Procedimientos y composiciones para producir análogos de receptores triméricos secretados y proteínas de fusión biológicamente activas.

Procedimiento para generar una proteína de fusión trimérica secretada,

que implica:

(a) crear un constructo de ADN (AND recombinado) que incluya un promotor de transcripción ligado a una matriz que codifique una secuencia de péptido señal seguido de una unión en fase en un polipéptido no colágeno que va a ser trimerizado, el cual es un polipéptido biológicamente activo o un receptor soluble que consiste de un/unos dominio/s de unión al ligando, y que a su vez está unido en fase a una porción C-terminal de procolágeno que es capaz de autotrimerizarse en una forma soluble con enlaces intermoleculares disulfuro unidos fuertemente de forma covalente;

(b) introducir dicho constructo de ADN en una célula eucariota;

(c) cultivar dicha célula huésped bajo condiciones fisiológicas en un medio de crecimiento adecuado para permitir la secreción de una proteína de fusión trimerizada soluble codificada por dicha secuencia de ADN; y

(d) aislar dicha proteína de fusión trimerizada del medio de cultivo de dicha célula huésped.

Procedimientos y composiciones para producir análogos de receptores triméricos secretados y proteínas de fusión biológicamente activas

CAMPO DEL INVENTO

El presente invento se refiere a procedimientos para la expresión de proteínas y, más específicamente, para crear y expresar proteínas triméricas secretadas y biológicamente activas, tales como receptores triméricos solubles.

ANTECEDENTES DEL INVENTO

En los organismos pluricelulares, como por ejemplo los seres humanos, las células se comunican entre sí por la llamada ruta de transducción de la señal, en la cual un ligando secretado (como por ejemplo citoquinas, factores de crecimiento u hormonas) se une a su/s receptor/es de la superficie celular, lo que lleva a la activación de dicho/s receptor/es. Los receptores son proteínas de membrana que consisten de un dominio extracelular responsable de la unión al ligando, y de una región central transmembrana seguida de un dominio citoplasmático encargado de enviar la señal hacia abajo en la ruta. La transducción de la señal puede tener lugar de tres formas distintas dependiendo de la fuente de la señal secretada y de la ubicación de la célula diana que expresa el/los receptor/es: de forma paracrina (comunicación entre células vecinas) , de forma autocrina (comunicación hacia la propia célula) o de forma endocrina (comunicación entre células distantes a través de la circulación) . Uno de los mecanismos generales que subyace a la activación del receptor y que pone en marcha la cascada de eventos bajo la membrana celular, incluyendo la activación de la expresión génica, es un ligando polipeptídico, como por ejemplo una citoquina, presente en su forma oligomérica, como un homo-dímero o trímero, que cuando se une a su receptor monomérico en la superficie exterior de las células lleva a la oligomerización del receptor. Las rutas de transducción de la señal desempeñan un papel clave en el desarrollo normal de las células y en su diferenciación, así como en la respuesta a ataques externos tales como infecciones bacterianas o víricas. Determinadas anomalías en estas rutas de transducción de la señal, ya sea en forma de subactivación (por ejemplo con la falta de ligando) o bien de sobreactivación (por ejemplo con un exceso de ligando) , son las causas subyacentes de condiciones patológicas y enfermedades tales como la artritis, el cáncer, el SIDA o la diabetes. Una de las actuales estrategias para el tratamiento de estas enfermedades debilitantes se basa en el uso de receptores señuelo, tales como receptores solubles que consisten tan solo del dominio de unión al ligando extracelular, para interceptar el ligando y por lo tanto superar la sobreactivación del receptor. El mejor ejemplo de esta estrategia es la creación de Enbrel, una proteína de fusión dimérica soluble receptor TNF-α - inmunoglobulina (IgG) por Immunex (Mohler et al., 1993; Jacobs et al., 1997) , que ahora forma parte de Amgen. La familia TNF de citoquinas es una de las principales señales proinflamatorias producidas por el cuerpo en respuesta a una infección o una lesión tisular. Sin embargo, se ha demostrado que la producción anormal de estas citoquinas, por ejemplo en ausencia de infección o lesión de los tejidos, es una de las causas subyacentes de enfermedades como la artritis y la psoriasis. En la superficie celular está presente de forma natural un receptor TNF-α en su forma monomérica antes de la unión a su ligando, el TNF-α, que existe, por el contrario, como un homotrímero (Locksley et al., 2001) . En consecuencia, la fusión de un receptor TNF-α soluble con la región Fc de la inmunoglobulina G1, que es capaz de una dimerización espontánea a través de enlaces disulfuro (Sledziewski et al., 1992 y 1998) , permite la secreción de un receptor TNF-α dimérico soluble (Mohler et al., 1993; Jacobs et al., 1997) . En comparación con el receptor soluble monomérico, la unión dimérica receptor TNF-αII - Fc tiene una afinidad mucho mayor al ligando homotrimérico. Esto proporciona una base molecular para su uso clínico en el tratamiento de la artritis reumatoide (AR) , una enfermedad autoinmune en la cual niveles constitutivamente altos de TNF-α, una citoquina proinflamatoria importante, juegan un papel clave en la causa de la enfermedad. Aunque Enbrel ha demostrado tener valores de Ki para TNF-α que se encuentran en el rango de pM (ng/mL) (Mohler et al., 1993) , en los pacientes con AR son necesarias inyecciones subcutáneas de 25 mg dos veces por semana para lograr beneficios clínicos, lo que se traduce en niveles del receptor soluble de mg/mL (www.enbrel.com) . El alto nivel de consumo recurrente de Enbrel por los pacientes con AR ha generado una gran presión así como un alto coste en lo que respecta al suministro del medicamento, lo que por sí solo limita el acceso al mismo a millones de pacientes potenciales ya solo en este país. Además de la familia TNF-α de las importantes citoquinas proinflamatorias, el virus del VIH que causa el SIDA también utiliza una proteína de cubierta homo-trimérica, la gp120, para poder entrar en las células T colaboradoras CD-4 positivas en nuestro cuerpo (Kwong et al., 1998) . Uno de los primeros eventos durante la infección por VIH implica la unión de la gp120 a su receptor CD-4, expresado únicamente en la superficie celular de las células T colaboradoras (Clapham et al., 2001) . Hace una década se demostró que el CD-4 monomérico soluble es un agente potente contra la infección por VIH (Clapham et al., 1989) . Sin embargo, por desgracia, el entusiasmo cayó cuando se demostró que su capacidad estaba limitada únicamente a cepas de VIH del laboratorio (Daar et al., 1990) . Resultó que las cepas de VIH de pacientes con SIDA tenían una afinidad mucho menor al CD-4 monomérico soluble que las cepas de laboratorio, probablemente debido a la variación de la secuencia en la gp120 (Daar et al., 1990) . Aunque se han desarrollado proteínas de fusión diméricas solubles Fc - CD-4, estos receptores señuelo CD-4 del VIH mostraron poco efecto antiviral, tanto en los laboratorios como en las clínicas, contra los VIH que se dan de forma natural en los pacientes con SIDA, debido a la baja afinidad por la gp120 (Daar et al., 1990) .

Es por ello que existe una gran necesidad de crear receptores homotriméricos solubles secretados o proteínas biológicamente activas, las cuales pueden tener sitios de unión perfectamente acoplados, y por lo tanto una mayor afinidad, a sus ligandos homotriméricos presentes en la naturaleza, tales como la familia TNF de las citoquinas y las proteínas de cubierta del VIH. Tales receptores señuelo triméricos deberían tener teóricamente una afinidad mucho mayor por su ligando trimérico que sus homólogos diméricos. Estos análogos de receptores triméricos solubles diseñados de forma racional podrían aumentar significativamente los beneficios clínicos, así como reducir la cantidad o la frecuencia de las inyecciones de medicamentos para cada paciente. Para ser terapéuticamente factible, como la inmunoglobulina Fc, idealmente la fracción de la proteína de trimerización deseada debe ser parte de una proteína secretada de forma natural que sea a su vez abundante en el cuerpo y capaz de autotrimerizarse de forma eficiente. El colágeno es una familia de proteínas fibrosas que representan los componentes principales de la matriz extracelular. Es la proteína más abundante de los mamíferos, y constituye casi el 25% de las proteínas totales del cuerpo. El colágeno juega un papel estructural importante en la formación de huesos, tendones, piel, córneas, cartílagos, vasos sanguíneos y dientes (Str y er, 1988) . Los tipos fibrilares de colágeno I, II, III, IV, V y XI se sintetizan como precursores triméricos más grandes denominados procolágenos, en los que el dominio de triple hélice central no interrumpida que consta de cientos de repeticiones "GXY" (o repeticiones de glicina) está acompañado de los dominios no colágeno (NC) , el N- propéptido y el C-propéptido (Str y er, 1988) . Tanto la extensión C– como la Nterminal se procesan proteolíticamente después de la secreción del procolágeno, un evento que desencadena el ensamblaje de la proteína madura en las fibrillas de colágeno, las cuales forman una matriz celular insoluble (Prockop et al., 1998) . El trímero C-propéptido de colágeno de tipo I se encuentra en la sangre de las personas sanas en una concentración que se encuentra entre 100 y 600 ng/mL, presentando niveles más altos en los niños, los cuales son indicativos de la formación activa de hueso. Los colágenos de tipo I, IV, V y XI están ensamblados principalmente en formas heterotriméricas que consisten en dos cadenas α-1 y una cadena α-2 (para los tipos... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para generar una proteína de fusión trimérica secretada, que implica:

(a) crear un constructo de ADN (AND recombinado) que incluya un promotor de transcripción ligado a una matriz que codifique una secuencia de péptido señal seguido de una unión en fase en un polipéptido no colágeno que va a ser trimerizado, el cual es un polipéptido biológicamente activo o un receptor soluble que consiste de un/unos dominio/s de unión al ligando, y que a su vez está unido en fase a una porción C-terminal de procolágeno que es capaz de autotrimerizarse en una forma soluble con enlaces intermoleculares disulfuro unidos fuertemente de forma covalente;

(b) introducir dicho constructo de ADN en una célula eucariota;

(c) cultivar dicha célula huésped bajo condiciones fisiológicas en un medio de crecimiento adecuado para permitir la secreción de una proteína de fusión trimerizada soluble codificada por dicha secuencia de ADN; y

(d) aislar dicha proteína de fusión trimerizada del medio de cultivo de dicha célula huésped.

2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1 en el que la proteína de fusión polipeptídica trimerizada es un homotrímero soluble.

3. Procedimiento conforme a la reivindicación 1 en el que el residuo de polipéptido trimerizado comprende la porción C-terminal de colágeno que es capaz de auto-ensamblarse en un trímero soluble seleccionado de un grupo que consiste de pro.alfa.1 (I) , pro.alfa 2 (I) , pro.alfa.1 (II) , pro.alfa.1 (III) , pro.alfa.1 (V) , pro.alfa2 (V) , pro.alfa.1 (XI) , pro.alfa.2 (XI) y pro.alfa.3 (XI) .

4. Procedimiento conforme a las reivindicaciones 1 a 3, en el cual la secuencia de péptido señal y el polipéptido no colágeno que va a ser trimerizado proceden de la misma proteína secretada nativa.

5. Procedimiento conforme a las reivindicaciones 1 a 4, en el cual tanto la secuencia de péptido señal como el polipéptido no colágeno que va a ser trimerizado se seleccionan a partir de dos proteínas secretadas distintas.

6. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el cual la célula eucariota huésped es una célula procedente de hongos o de insectos.

7. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el cual la célula eucariota huésped es una línea celular de mamíferos cultivada.

8. Procedimiento conforme a las reivindicaciones 1 a 3, en el cual la porción C-terminal del procolágeno incluye una región de colágeno de triple hélice de "glicina - repetida" unida al C-propéptido.

9. Procedimiento conforme a la reivindicación 8, en el cual la porción C-terminal de procolágeno está identificada con los números de ID de secuencia 1-2.

10. Procedimiento conforme a las reivindicaciones 1 a 3, en el cual la porción C-terminal de trimerización de procolágeno comprende únicamente un C-propéptido sin una región de colágeno de triple hélice de "glicina repetida".

11. Procedimiento conforme a las reivindicaciones 8 a 10, en el cual la porción C-terminal de trimerización del procolágeno comprende una secuencia de reconocimiento de la proteasa BMP-1 mutada o suprimida, confiriendo de este modo a las proteínas de fusión triméricas resistencia a la degradación por las proteasas BMP -1.

12. Procedimiento conforme a las reivindicaciones 10 a 11, en el cual la porción C-terminal de trimerización de procolágeno está identificada por los números de ID de secuencia 3-4.

13. Composiciones de proteínas de fusión secretadas generadas por los procedimientos de las reivindicaciones 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11 y 12, siendo el receptor soluble trimérico humano TNF-α II (p75) identificado por los números de ID de secuencia 9-12.

14. Composiciones de proteínas de fusión secretadas generadas por los procedimientos de las reivindicaciones 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11 y 12, siendo los CD4 triméricos humanos solubles identificados por los números de ID de secuencia 13-16.

15. Composiciones de proteínas de fusión secretadas generadas por los procedimientos de las reivindicaciones 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11 y 12, siendo la fosfatasa alcalina de placenta humana trimérica soluble identificada por los números de ID de secuencia 5-8.

16. Receptor soluble TNF-α II trimerizado que comprende tres cadenas polipeptídicas, incluyendo cada una de dichas cadenas polipeptídicas un dominio de unión al ligando del receptor, unido a un C-propéptido de colágeno, en cuyo caso la trimerización de la fusión polipeptídica resulta en la mejora de la actividad biológica hacia TNF-α.

17. Producto o composición para ser usada en un tratamiento médico mediante el bloqueo de la actividad biológica del TNF-α usando un receptor soluble TNF-α II trimerizado generado conforme a la reivindicación 13.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

La lista de referencias citada por el solicitante lo es solamente para utilidad del lector, no formando parte de los documentos de patente europeos. Aún cuando las referencias han sido cuidadosamente recopiladas, no pueden 5 excluirse errores u omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citado en la descripción

• EP 0985732 A2 [0009] • US 10677877 B [0038]

• WO 02090553 A2 [0010]

Bibliografía de patentes citada en la descripción

• MOHLER et al. J Immunol., 1993, vol. 151 (3) , • KISHORE et al. J. Immunol, 2001, vol. 166, 1548-61 [0008.

55. 565 [0012]

• HAYASHI et al. Biochim Biophys Acta, 2001, • HOLLER et al. J Immunol Methods, 2000, vol. vol. 1528.

18. 95 [0011] 237 (1-2) .

15. 73 [0013]