Un ARNsi o ARNsh desnudo o uno de sus moldes de transcripción para su uso en el tratamiento de unainfección por VHC en un mamífero no embrionario,

en el que el ARNsi o ARNsh tiene entre 15 y 30 nucleótidos delongitud y el gen de VHC objetivo es el NS5B.

Procedimientos y composiciones para la inhibición mediada por ARNi de la expresión génica en mamíferos

Campo de la invención

El campo de esta invención es el ARNi.

Antecedentes de la invención

El ARN bicatenario induce un silenciamiento génico potente y específico a través de un proceso al que se hace referencia como interferencia de ARN (ARNi) o silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) . El ARNi está mediado por el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) , una nucleasa multicomponente específica de secuencia que destruye ARN mensajeros homólogos al desencadenante del silenciamiento. Se sabe que RISC contiene ARN cortos (de aproximadamente 22 nucleótidos) derivados del ARN bicatenario desencadenante.

El ARNi se ha convertido en el procedimiento de elección para las investigaciones de pérdida de función en numerosos sistemas, incluidos C. elegans, Drosophila, hongos, vegetales e incluso líneas celulares de mamífero. Para silenciar específicamente un gen en la mayoría de las líneas celulares de mamíferos, se usan ARN de interferencia pequeños (ARNsi) porque los ARNds (>30 pb) desencadenan la respuesta de interferón y provocan silenciamiento génico no específico.

Hasta la fecha, los solicitantes no tienen conocimiento de que se haya informado de ninguna aplicación con éxito de tecnología de ARNi a organismos mamíferos no embrionarios. La demostración de que el ARNi funciona en organismos mamíferos no embrionarios proporcionaría una serie de importantes aplicaciones adicionales para la tecnología de ARNi, incluidas aplicaciones tanto de investigación como terapéuticas y, por lo tanto, es de gran interés.

Literatura pertinente

El documento WO 01/68836. Véanse también: Bernstein et al., RNA (2001) 7: 1509-1521; Bernstein et al., Nature (2001) 409: 363-366; Billy et al., Proc. Nat'l Acad. Sci USA (2001) 98:14428-33; Caplan et al., Proc. Nat'l Acad. Sci USA (2001) 98: 9742-7; Carthew et al., Curr. Opin. Cell Biol (2001) 13: 244-8: Elbashir et al., Nature (2001) 411: 494-498; Hammond et al., Science (2001) 293:1146-50; Hammond et al., Nat. Ref. Genet. (2001) 2:110-119; Hammond et al., Nature (2000) 404:293-296; McCaffrrey et al., Nature (2002) : 418-38-39; y McCaffrey et al., Mol. Ther. (2002) 5:676-684; Paddison et al., Genes Dev. (2002) 16:948-958; Paddison et al., Proc. Nat'l Acad. Sci USA (2002) 99:1443-48; Sui et al., Proc. Nat'l Acad. Sci USA (2002) 99:5515-20.

Las patentes de EE. UU. de interés incluyen la 5.985.847 y la 5.922.687. También es de interés el documento WO/11092. Las referencias de interés adicionales incluyen: Acsadi et al., New Biol. (Ene. 1991) 3:71-81; Chang et al., J. Virol. (2001) 75:3469-3473; Hickman et al., Hum. Gen. Ther. (1994) 5:1477-1483; Liu et al., Gene Ther. (1999) 6:1258-1266; Wolff et al., Science (1990) 247: 1465-1468; y Zhang et al., Hum. Gene Ther. (1999) 10:1735-1737: y Zhang et al., Gene Ther. (1999) 7:1344-1349.

Sumario de la invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones. En términos generales, se proporcionan composiciones para su uso en la modulación , p. ej., reducción de la expresión de secuencias codificantes en mamíferos. Se administra una cantidad eficaz de un agente de ARNi, p. ej., un ácido ribonucleico de interferencia (tal como un ARNsi o ARNsh) o uno de sus moldes de transcripción, p. ej, un ADN que codifica un ARNsh, a un mamífero no embrionario, p. ej., mediante un protocolo de administración hidrodinámica. También se proporcionan preparaciones farmacéuticas de agente de ARNi para su como se define por las reivindicaciones. Los procedimientos y composiciones descritas también en el presente documento pueden usarse en una variedad de aplicaciones diferentes, incluidas aplicaciones teóricas y terapéuticas.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 proporciona construcciones de expresión empleadas en los experimentos de ARNi descritos más adelante.

Figuras 2A a 2D: interferencia de ARN en ratones adultos. Figura 2A) imágenes representativas de la luz emitida por ratones cotransfectados con el plásmido de luciferasa pGL3-Control y sin ARNsi (izquierda) , con ARNsi de luciferasa (centro) o con ARNsi no relacionado (derecha) . Una imagen en pseudocolor que representa la intensidad de la luz emitida (lo más intenso en rojo y lo menos en azul) superpuesta en una imagen de referencia en escala de grises (para orientación) muestra que el ARNi funciona en mamíferos adultos. Se coinyectaron cuarenta μg de ARNsi de 21 meros alineados (Dharmacon) en los hígados de ratones con los 2 μg de ADN de pGL3-Control y 800 unidades de ARNasina (Promega) en 1, 8 ml de PBS en 5-7 segundos. Setenta y dos horas después de la inyección inicial, los ratones se anestesiaron y se les administraron 3 mg de luciferina por vía intraperitoneal 15 min antes de la formación de imágenes. Figura 2B) Resumen de datos de ARNsi. Los ratones que recibieron el ARNsi de luciferasa emitieron significativamente menos luz que los controles no tratados. Se llevó a cabo un análisis ANOVA unidireccional en una prueba de Fisher a posteriori. Los grupos no tratados y con ARNsi no relacionado fueron estadísticamente similares. Figura 2C) El pShh1-Ff1 (centro) , pero no el pShh1-Ff1rev (derecha) , redujo la expresión de la luciferasa en ratones en comparación con el control no tratado (izquierda) . Se coinyectaron 10 μg de pShh1-Ff1 o pShh1-rev con 40μg de pLuc-NS5B en 1, 8 ml de PBS. Figura 2D) Cuantificación de los datos de pShh1. Los animales se trataron de acuerdo con las directrices del NIH para el cuidado de animales y las directrices de la Universidad de Stanford.

La figura 3 proporciona una representación esquemática de las construcciones empleadas en el ensayo de inhibición de VHC antisentido morfolino fosforamidato realizado en la sección experimental, más adelante. La figura 4 proporciona información básica sobre el mecanismo de los inhibidores antisentido.

Las figuras 5A a 5F proporcionan resultados gráficos de un ensayo de inhibición de VHC antisentido morfolino fosforamidato realizado de acuerdo con la invención de referencia.

Definiciones

Por comodidad, se recogen aquí ciertos términos empleados en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas.

Como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha enlazado. Un tipo de vector es un vector integrado genómico, el "vector integrado", que puede integrarse en el ADN cromosómico de la célula huésped. Otro tipo de vector es un vector episómico, es decir, un ácido nucleico capaz de duplicarse extracromosómicamente en un huésped apropiado, p. ej., una célula huésped procariota o eucariota. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los que están enlazados de forma funcional se denominan en el presente documento "vectores de expresión". En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se usan indistintamente a menos que se desprenda lo contrario del contexto.

Como se usa en el presente documento, el término "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) y, cuando proceda, ácido ribonucleico (ARN) . Asimismo, debería entenderse que el término incluye, según sea aplicable a la realización descrita, polinucleótidos monocatenarios (tales como sentido o antisentido) y bicatenarios.

Como se usa en el presente documento, el término "gen" o "gen recombinante" se refiere a un ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de la presente invención, que incluye secuencias tanto exónicas como (opcionalmente) intrónicas. Un "gen recombinante" se refiere a un ácido nucleico que codifica tales polipéptidos reguladores, que puede incluir, opcionalmente, secuencias intrónicas que derivan de ADN cromosómico. El término "intrón" se refiere a una secuencia de ADN presente en un gen dado que no se traduce en proteína y que, en general, se encuentra entre exones. Como se usa en el presente documento, el término "transfección" significa la introducción de un ácido nucleico, p. ej., un vector de expresión, en una célula receptora mediante transferencia génica mediada por ácidos nucleicos.

Una "secuencia codificante de proteína" o una secuencia que "codifica" un polipéptido o péptido en particular, es una secuencia de... [Seguir leyendo]

1. Un ARNsi o ARNsh desnudo o uno de sus moldes de transcripción para su uso en el tratamiento de una infección por VHC en un mamífero no embrionario, en el que el ARNsi o ARNsh tiene entre 15 y 30 nucleótidos de longitud y el gen de VHC objetivo es el NS5B.

2. El ARNsi o ARNsh o su molde de transcripción de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho ARNsi o ARNsh tiene de 21 a 22 nucleótidos de longitud.

3. El ARNsi o ARNsh o su molde de transcripción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicha secuencia génica objetivo es un transcrito de NS5B.

4. El ARNsi o ARNsh o su molde de transcripción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en 10 el que dicho mamífero no embrionario es un adulto.

5. El ARNsi o ARNsh o su molde de transcripción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho mamífero no embrionario es joven.

6. El ARNsi o ARNsh o su molde de transcripción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho ARNsi o ARNsh ha de administrarse hidrodinámicamente a dicho mamífero no embrionario.

7. El ARNsi o ARNsh de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho ARNsi o ARNsh ha de administrarse junto con un inhibidor de ARNasa.

8. El ARNsi o ARNsh o su molde de transcripción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que ha de administrarse por vía intravenosa.

9. El ARNsi o ARNsh o su molde de transcripción de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho ARNsi o 20 ARNsh desnudo o uno de sus moldes de transcripción se ha de administrar a una célula del hígado.