Procedimientos basados en los microARN para el diagnóstico y el pronóstico del cáncer de pulmón.

Un procedimiento para diagnosticar si un sujeto tiene cáncer de pulmón,

que comprende la medición del nivel deal menos un producto génico del miR en una muestra de ensayo de dicho sujeto, en el que una alteración del niveldel producto génico del miR en la muestra de ensayo, con respecto al nivel de un producto génico correspondientedel miR en una muestra de control, es indicativa de que el sujeto tiene cáncer de pulmón, en el que el al menos unproducto génico del miR se selecciona entre el grupo que consiste en miR-155.

Procedimientos basados en los microARN para el diagnóstico y el pronóstico del cáncer de pulmón Apoyo Gubernamental

Esta invención se llevó a cabo con el apoyo, en su totalidad o en parte, con la subvención CA76259 y los fondos propios de CCR/NCI/NIH y por los fondos Federales de NCI/NIH bajo el Contrato Nº NO1-CO-12400. El Gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.

Antecedente de la invención El cáncer de pulmón causa más muertes en todo el mundo que cualquier otra forma de cáncer (Goodman, G.E., Thorax 57: 994-999 (2002) ) . En los Estados Unidos, el cáncer de pulmón es la primera causa de muerte por cáncer tanto entre hombres como entre mujeres. En 2002, la tasa de mortalidad por cáncer de pulmón se estimó en 134.900 muertes. El cáncer de pulmón también encabeza las muertes por cáncer en todos los países europeos y el número de muertes relacionadas con el cáncer de pulmón está aumentando rápidamente en los países en desarrollo.

La tasa de supervivencia a los cinco años entre todos los pacientes de cáncer de pulmón, sin tener en cuenta el estadio de la enfermedad en el momento del diagnóstico, es solo de aproximadamente el 13 %. Esto contrasta con una tasa de supervivencia a los cinco años del 46 % entre los casos detectados cuando la enfermedad está aún localizada. Sin embargo, solo el 16 % de los cánceres de pulmón se descubren antes de que la enfermedad se haya extendido. La detección precoz es difícil porque los síntomas clínicos a menudo no se observan hasta que la enfermedad alcanza un estadio avanzado. Normalmente, el diagnóstico se ayuda del uso de radiografías de tórax, el análisis del tipo de células que contiene el esputo y el examen del tracto bronquial con fibra óptica. Los regímenes de tratamiento se determinan por el tipo y estadio del cáncer, e incluyen la cirugía, la radioterapia y/o la quimioterapia. A pesar de las considerables investigaciones en terapias para este y otros tipos de cáncer, el cáncer de pulmón sigue siendo difícil de diagnosticar y tratar eficazmente. Por lo tanto, existe una gran necesidad de mejores procedimientos para detectar y tratar tales cánceres.

Carbone, J Clin. Oncol. 23: 3219-3226 (2005) ; Granville y Dennis, Cell Mol. Biol. 32: 169-176 (2005) ) . Por ejemplo, son comunes los defectos en las rutas p53 y RB/p16 en el cáncer de pulmón. Varios genes distintos, tales como Kras, PTEN, FHIT and MYO18B, están alterados genéticamente en los cánceres de pulmón, aunque menos frecuentemente (Minna y col., Cancer Cell 1: 49-52 (2002) ; Sekido y col., Annu. Rev. Med. 54:73-87 (2003) ; Yokota y Kohno, Cancer Sci. 95: 197-204 (2004) ) . Aunque centrarse en los genes y proteínas conocidos ha dado una información útil, también se puede prestar atención a marcadores de cáncer de pulmón desconocidos previamente en la biología del cáncer de pulmón.

Los microARN (miARN) son una clase de ARN pequeños, no codificantes que controlan la expresión génica hibridándose con y desencadenando la represión traduccional o, menos frecuentemente, la degradación de un ARN mensajero (ARNm) diana. El descubrimiento y estudio de los miARN han revelado mecanismos génicos reguladores mediados por miARN que tienen papeles importantes en el desarrollo de organismos y varios procesos celulares, tales como diferenciación celular, crecimiento celular y muerte celular (Cheng, A.M. y col., Nucleic Acids Res. 33: 1290-1297 (2005) ) . Los estudios recientes sugieren que la expresión aberrante de miARN particulares puede estar implicada en enfermedades humanas, tales como trastornos neurológicos (Ishizuka, A. y col., Genes Dev. 16: 24972508 (2002) ) y cáncer. Los genes microARN están altamente asociados con las características cromosómicas implicadas en la etiología de distintos cánceres. Por lo tanto la evaluación de la expresión génica del miR puede utilizarse para indicar la presencia de una lesión cromosómica causante de cáncer en un sujeto. Como el cambio en el nivel de la expresión génica del miR producido por una característica cromosómica asociada con el cáncer puede contribuir también a cancerigénesis, un determinado cáncer se puede tratar restaurando el nivel de la expresión génica a los valores normales (documento WO 2005/078139) . En particular, se ha descubierto una expresión errónea de miR-16-1 y/o miR-15a en leucemias linfocíticas crónicas (Calin, G.A. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

99: 15524-15529 (2002) ) . Además, la expresión reducida del microARN let-7 en cánceres de pulmón humanos se correlacionó con la supervivencia tras la resección potencialmente curativa (Takamizawa J. y col., Cancer Research 64, 3753-3756, June 1 (2004) ) . La familia de los microARN let-7 regula negativamente el let-60/RAS. La expresión de let-7 es menor en tumores pulmonares que en el tejido pulmonar normal, al tiempo que la proteína RAS es significativamente más alta en los tumores pulmonares (Johnson S.M. y col., Cell 120, 635-647, March 11 (2005) ) .

El desarrollo y uso de micromatrices que contienen todos los microARN conocidos ha permitido un análisis simultáneo de la expresión de cada miARN en una muestra (Liu, C.G. y col., Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101: 97409744 (2004) ) . Estas micromatrices de microARN no sólo se han utilizado para confirmar que el miR-16-1 está mal regulado en las células humanas de LLC, sino también para generar firmas de expresión de miARN que se asocian con cuadros clinicopatológicos bien definidos de LLC humanas (Calin, G.A. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101: 1175-11760 (2004) ) . Se puede utilizar el aislamiento, el enriquecimiento y/o el marcado de moléculas de miARN para preparar matrices u otras técnicas de detección para el análisis de miARN. Los perfiles de miARN se pueden emplear en aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y pronósticas (documento WO 2005/118806) .

La identificación de microARN que se expresan diferencialmente en las células del cáncer de pulmón ayudaría al diagnóstico, el pronóstico y el tratamiento del cáncer de pulmón. Además, la identificación de las supuestas dianas de estos miARN ayudaría a desvelar su papel patogénico. La presente invención proporciona procedimientos nuevos y composiciones para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento del cáncer de pulmón.

Sumario de la invención La presente invención se basa, en parte, en la identificación de los miARN específicos asociados con niveles de expresión alterados en las células del cáncer de pulmón.

En consecuencia, la invención engloba procedimientos para diagnosticar si un sujeto tiene un cáncer de pulmón. Según los procedimientos de la invención, el nivel de al menos un producto génico del miR en una muestra de ensayo del sujeto se compara con el nivel de un correspondiente producto génico del miR en una muestra control. Una alteración (por ejemplo, un aumento, un descenso) del nivel del producto génico del miR en la muestra de ensayo, con respecto al nivel de un correspondiente producto génico del miR en la muestra control, es indicativa de que el sujeto tiene cáncer de pulmón. El al menos un producto génico del miR de los procedimientos de diagnóstico de la presente invención se selecciona entre el grupo que consiste en miR-155.

También se desvelan los miR-21, miR-191, miR-126*, miR-210, miR-143, miR-205, miR-192-prec, miR-224, miR126, miR-24-2, miR-30a-5p, miR-212, miR-140, miR-9, miR-214, miR-17-3p, miR-124a-1, miR-218-2, miR-95, miR145, miR-198, miR-216-prec, miR-219-1, miR-106a, miR-197, miR-192, miR-125a-prec, miR-26a-1-prec, miR-146, miR-203, miR-199b-prec, let-7a-2-prec, miR-27b, miR-32, miR-29b-2, miR-220, miR-33, miR-181c-prec, miR-150, miR-101-1, miR-124a-3, miR-125a y let-7f-1. En una divulgación en particular, el al menos un producto génico del miR se seleccionan entre el grupo que consiste en miR-21, miR-191, miR-155, miR-210, miR-126* y miR-224. En otra divulgación, el al menos un producto génico del miR se selecciona entre el grupo que consiste miR-21, miR-205 y miR-216. En otra divulgación más, el cáncer de pulmón es un adenocarcinoma de pulmón y el al menos un producto génico del miR se selecciona entre el grupo que consiste en miR-21, miR-191, miR-155, miR-210, miR126*, miR-126, miR-24-2, "miR-219-1, miR-95, miR-192-prec, miR-220, miR-216-prec, miR-204-prec, miR-188, miR198, miR-145 y miR-224.

El nivel del al menos un producto génico del miR se puede medir utilizando varias técnicas que son bien conocidas por los expertos en la técnica (por ejemplo, RT-PCR semicuantitativa o cuantitativa, análisis de transferencia de Northern, detección de hibridación en solución) . En una realización particular, el nivel de al menos un producto génico del miR se mide haciendo la transcripción inversa... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para diagnosticar si un sujeto tiene cáncer de pulmón, que comprende la medición del nivel de al menos un producto génico del miR en una muestra de ensayo de dicho sujeto, en el que una alteración del nivel del producto génico del miR en la muestra de ensayo, con respecto al nivel de un producto génico correspondiente del miR en una muestra de control, es indicativa de que el sujeto tiene cáncer de pulmón, en el que el al menos un producto génico del miR se selecciona entre el grupo que consiste en miR-155.

2. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 1 en el que el nivel del al menos un producto génico del miR en la muestra de ensayo es mayor que el nivel del producto génico correspondiente del miR en la muestra de control.

3. Un procedimiento para determinar el pronóstico de un sujeto con cáncer de pulmón, que comprende la medición del nivel de al menos un producto génico del miR en una muestra de ensayo de dicho sujeto, en el que:

el producto génico del miR está asociado con un pronóstico adverso del cáncer de pulmón; y una alteración del nivel del al menos un producto génico del miR en la muestra de ensayo de pulmón, con respecto al nivel del correspondiente producto génico del miR en una muestra de control, es indicativa de un pronóstico adverso en el que al menos un producto génico del miR se selecciona entre el grupo que consiste en miR-155.

4. Un procedimiento para diagnosticar si un sujeto tiene un cáncer de pulmón con un pronóstico adverso en un sujeto, que comprende:

(1) la transcripción inversa de ARN de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana;

(2) hibridar los oligodesoxinucleótidos diana con una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación de dicha muestra de ensayo; y

(3) comparar el perfil de hibridación de la muestra de ensayo con el perfil de hibridación generado a partir de una muestra de control, en el que una alteración de la señal es indicativa de que el sujeto tiene un cáncer de pulmón con un pronóstico adverso, en el que una alteración de la señal de al menos un producto génico del miR seleccionado entre el grupo que consiste en miR-155 es indicativa de que el sujeto tiene un cáncer de pulmón con un pronóstico adverso.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 en el que el cáncer de pulmón es un adenocarcinoma pulmonar.

6. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 4, en el que la micromatriz comprende al menos un oligonucleótido sonda específico de miARN para un miARN seleccionado entre el grupo que consiste en miR-155.