PROCEDIMIENTO Y SISTEMA DE MEDIDA DE VELOCIDAD DEL FLUJO SANGUÍNEO.

Procedimiento para medir la velocidad de un objeto microscópico en movimiento en el seno de un flujo,

como un flujo sanguíneo, a partir de un microscopio de barrido luminoso, este procedimiento comprende las etapas siguientes: - adquisición de una imagen por barrido luminoso x e y de un plano que contiene dicho objeto; - detección en el plano (x, y) de una estría engendrada por el desplazamiento de dicho objeto en el momento de la adquisición de dicha imagen; el procedimiento está caracterizado por que comprende las etapas que consisten en - la determinación de la pendiente de dicha estría en el plano (x, y); y - la estimación de la velocidad Vg de dicho objeto a partir de la pendiente así determinada

Procedimiento y sistema de medida de velocidad del flujo sanguíneo.

La presente invención se refiere a un procedimiento para medir la velocidad de un objeto microscópico en movimiento en un flujo, como un flujo sanguíneo, utilizando un microscopio de barrido luminoso.

Se aplica particularmente pero no exclusivamente al estudio de la microcirculación en el cual la problemática es detectar partículas tales como glóbulos rojos o leucocitos en desplazamiento, estimar la dirección de desplazamiento de estas partículas así como sus velocidades.

La invención presente puede no obstante aplicarse a otros campos tales como por ejemplo los microfluidos.

La estimación de la velocidad de desplazamiento de un objeto utilizando un sistema de formación de imágenes se hace convencionalmente a partir de una secuencia de imágenes representando este objeto en movimiento. La hipótesis de base es que la velocidad de adquisición del sistema de formación de imágenes es tal que el objeto efectúa pequeños desplazamientos de una imagen a otra. La presencia del objeto, en diferentes posiciones, sobre la serie temporal de imágenes permite entonces determinar, mediante un calibrado del sistema de adquisición, la velocidad de este último.

Se conoce el documento "Erythrocite velocity measurement in microvessels by a two-slit photometric method" de H. Wayland y RC. Johnson, publicado en J. Appl. Physiol. 22 (2): 333-337, 1967, y que describe un método fotométrico de dos hendiduras. La medida por método fotométrico de dos hendiduras es probablemente la técnica más antigua de medida automatizada de velocidad del flujo sanguíneo. Este método mide la velocidad de los glóbulos rojos y se aplica preferentemente a los capilares y a las pequeñas venillas por las cuales circulan en fila los glóbulos, aislados o por pequeños agregados. La medida se hace sobre una vídeo secuencia, con la ayuda de dos hendiduras colocadas sobre la pantalla mostrando la secuencia. Ambas hendiduras son paralelas y están orientadas perpendicularmente al vaso sobre el cual se realiza la medida. Un fotodiodo está presente frente a cada una de las hendiduras. El aparato utilizado propone dos modos de medidas. En un primer modo, las dos hendiduras están espaciadas (en distancia equivalente sobre el tejido) de 45 μm a 70 μm. La medida de velocidad se realiza por un cálculo de la intercorrelación de las dos señales provenientes de los fotodiodos. En el segundo modo de medida, las dos hendiduras están muy próximas 7,4 μm en distancia equivalente tejido, es decir una distancia ligeramente inferior al diámetro medio de un glóbulo rojo. En consecuencia, dos señales consecutivas generadas respectivamente por el diodo de entrada y el diodo de salida son causadas por el mismo glóbulo, y es posible pues calcular la velocidad de este glóbulo. Sin embargo, las limitaciones del método son la necesidad de hacer la medida sobre vasos muy finos con el fin de limitar la observación a un glóbulo rojo, y las velocidades medidas, que debido a la frecuencia de imágenes de 30 imágenes por segundo, no pueden sobrepasar los 2 mm/s.

También se conoce el método de la proyección espacio-temporal ("Line shift Diagram"). Este método es una extensión de la precedente. En lugar de muestrear la señal en dos puntos, el usuario selecciona una zona de interés, es decir un rectángulo marcado en un vaso. En cada imagen, una media de los niveles de gris es calculada sobre la anchura del vaso en cada punto del eje del vaso, la señal de la zona de interés es proyectada en una dimensión sobre el eje del vaso. Luego las señales unidimensionales obtenidas para cada imagen son alineadas verticalmente para dar una imagen espacio-temporal que deja aparecer las huellas de los glóbulos. La velocidad es estimada correlacionando las señales adyacentes. Este método es utilizado por el software CapImage® y Capiscope®, acompañado con el aparato de adquisición Cytoscan®. Dicho método se describe particularmente en el documento "Ortogonal Polarisation Spectral Imagina: A new method for study of microcirculation." de W. Groner, I.W. Winkelman, A.G. Harris, G. Inde, G.I. Bouma, K. Messmer, y R.G. Nadeau, publicado en Nature Medecine, 5 :1209-1213, 1999. La principal limitación es la gama de velocidad medida, que no puede sobrepasar los 2 mm/s debido a la frecuencia de las imágenes (25 imágenes/segundo ó 50 imágenes/segundo si las medidas son realizadas alternativamente sobre ambos campos entrelazados del flujo vídeo).

El SLO para "Scanning Laser Ophtalmoscope" en lengua inglesa, es un aparato cuyo principio se basa en la microscopía confocal no fibrada. Las imágenes son capturadas a una velocidad de 50 imágenes entrelazadas por segundo. El método de medida de velocidad utilizado por este aparato se basa en el control de célula. Una misma imagen está constituida por campos entrelazados correspondientes a dos instantes espaciados por 20 ms, un glóbulo en movimiento aparece pues en dos lugares diferentes sobre la imagen, una vez sobre las líneas pares y otra vez sobre las líneas impares. Una vez localizadas las dos imágenes del glóbulo, la medida de la velocidad es inmediata. El gran campo del aparato (hasta 1200 μm permite medir velocidades de varios cm/s). Las limitaciones de este aparato son debidas principalmente al control de los glóbulos: hacen falta glóbulos señalados de gran tamaño (12 μm para los leucocitos) y en pequeño número. Dicho método parece inaplicable a la medida de velocidad de glóbulos rojos, cuyas dimensiones son más pequeñas (7 - 8 μm), de concentración mucho más fuerte (1.000 veces más importante que la de los glóbulos blancos) y más difíciles de señalar.

Otro método de medida que está asociado corrientemente con el Cytoscan ® o el SLO es la medida de velocidad de glóbulos rojos por efecto Doppler. El efecto Doppler describe la diferencia frecuencial que experimenta una onda reflejada por un objeto en movimiento con relación al observador. En el caso del flujo sanguíneo, los objetos en movimiento son los glóbulos rojos. Una onda monofrecuencial (por ejemplo un láser) de longitud de onda determinada es enviada sobre un vaso sanguíneo. La medida de la velocidad por efecto Doppler tiene la ventaja de ser muy rápida y precisa. Según el material y los programas de análisis utilizados las velocidades máximas mensurables varían de 1 mm/s a varios cm/s. Un inconveniente del Doppler viene dado por la dificultad en identificar precisamente la zona sobre la cual la velocidad es medida, sobre todo en profundidad. La luz reflejada puede provenir de diferentes vasos dónde la sangre circula a velocidades diferentes.

Todavía conocemos el método por Análisis Espacio-temporal. Dicho método para la medida de la velocidad de leucocitos se describe en el documento "Measuring microcirculation using spatiotemporal llena de image analysis". Por Yoshinobu Sato et al., CVRMed, páginas 302-308, 1995. Este análisis contiene tres etapas principales: i) en un primer paso, el vaso es extraído de la imagen por una segmentación hecha sobre el histograma de las varianzas temporales de los píxeles de las tramas de la secuencia. ii) Una imagen espacio-temporal es entonces construida a partir de las imágenes sucesivas del vaso. Esta imagen puede ser tridimensional, o bidimensional si cada imagen de la secuencia es proyectada sobre el eje o los contornos del vaso. iii) Las huellas dejadas en la imagen espacio-temporal por el movimiento de los leucocitos son luego reforzadas por la aplicación de un banco de filtros de orientación selectiva (por ejemplo un banco de filtros de Gabor). Las huellas son extraídas por el método del valor umbral de las mejores respuestas. La última etapa consiste en conectar entre ellas las huellas para reconstituir las trayectorias enteras de los leucocitos. La obtención de estas huellas permite luego por un cálculo de sus tangentes tener una estimación de la velocidad de los leucocitos sobre sus trayectorias.

El documento US 6 473 698 describe un método según el preámbulo de la reivindicación 1.

También en el área del análisis espaciotemporal, se conocen los documentos:

- "Two-photon imaging of neocortical microcirculation". D. Kleinfeld and W. Denk; In Imaging Neurons: A Laboratory Manual (R. Yuste, F. Lanni, y A. Konnerth, editors), 1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, pp. 23.1-23.15; accesible en Internet en la dirección siguiente: http://physics.ucsd.edu/neurophysics/publications/kleinfeld_ denk_cshl_2003.pdf;...

1. Procedimiento para medir la velocidad de un objeto microscópico en movimiento en el seno de un flujo, como un flujo sanguíneo, a partir de un microscopio de barrido luminoso, este procedimiento comprende las etapas siguientes:

- adquisición de una imagen por barrido luminoso x e y de un plano que contiene dicho objeto;

- detección en el plano (x, y) de una estría engendrada por el desplazamiento de dicho objeto en el momento de la adquisición de dicha imagen; el procedimiento está caracterizado por que comprende las etapas que consisten en

- la determinación de la pendiente de dicha estría en el plano (x, y); y

- la estimación de la velocidad V_g de dicho objeto a partir de la pendiente así determinada.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que la etapa de la detección de la estría comprende las etapas siguientes

- acentuación de un conjunto de estrías de la imagen por aplicación de un filtro;

- aplicación de un umbral para conservar las estrías más importantes;

- ajuste de una recta o de una elipse sobre cada una de estas estrías; e

- identificación de dicha estría.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por que la velocidad V_g de dicho objeto está determinada por la relación siguiente

V_g*cos (θ) = V_y/tan (α) con V_y la velocidad vertical del punto luminoso utilizado para el barrido, y "α" el ángulo entre el eje horizontal "x" y la estría.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que el ángulo θ se obtiene por detección de los bordes de vasos sanguíneos que transportan el objeto.

5. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que para obtener el ángulo θ, se asimila dicho objeto a un palito vertical de altura terminada D y se calcula el ángulo θ a partir de la relación siguiente:

en donde L es la longitud de la estría.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por que en caso en que V_g*sen (θ) <Vy:

7. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por que en caso en que V_g*sen (θ)> V_y:

8. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que se adquiere una segunda imagen del mismo plano pero en un barrido inverso, y se utiliza la relación siguiente:

en donde L' es la longitud de la estría en el momento del barrido inverso.

9. Procedimiento según la reivindicación 8 y 5, caracterizado por que cuando |Vg* sen (θ)| <|Vy|:

en donde L es la longitud de la estría en el primer sentido de barrido, y L' la longitud de la estría en el momento del barrido inverso.

10. Procedimiento según la reivindicación 5 y 8, caracterizado por que cuando |V_g*sen (θ)| > |Vy|:

11. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que cuando V_g*sen (θ) = V_y, para determinar a V_g y θ se utiliza además la relación siguiente:

12. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que dicho objeto es un glóbulo rojo, se asimila su forma sobre la imagen adquirida a una elipse de radio R cuyo ángulo α entre la estría y el eje "x" está determinado por:

Y/y la longitud principal del eje está determinada por:

Con

13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que se utiliza un microscopio confocal.

14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que se utiliza un microscopio de barrido luminoso en modo fibrado.

15. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por que se utiliza un microscopio de barrido luminoso no fibrado.

16. Sistema de microscopio de barrido luminoso, utilizado para medir la velocidad de un objeto microscópico en movimiento en el seno de un flujo, tal como un flujo sanguíneo, este sistema que aplica un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes; este sistema comprende:

- medios para adquirir una imagen por barrido luminoso x e y de un plano que contiene dicho objeto;

- medios para detectar en el plano (x, y) una estría engendrada por el desplazamiento de dicho objeto en el momento de la adquisición de dicha imagen;

- medios para determinar en el plano (x, y) la pendiente de dicha estría; y

- medios para estimar la velocidad V_g de dicho objeto a partir de la pendiente así determinada.

17. Sistema según la reivindicación 16, caracterizado por que en el curso de la detección de la estría, el sistema comprende:

- medios para acentuar un conjunto de estrías de la imagen por aplicación de un filtro;

- medios para aplicar un umbral para conservar las estrías más importantes;

- medios para ajustar una elipse sobre cada una de estas estrías; y

- medios para identificar dicha estría.

18. Sistema según reivindicaciones 16 ó 17, caracterizado por que se utiliza un microscopio confocal.

19. Sistema según uno cualquiera reivindicaciones 16 a 18, caracterizado por que se utiliza un microscopio de barrido luminoso en modo fibrado.

20. Sistema según uno cualquiera reivindicaciones 16 a 18, caracterizado por que se utiliza un microscopio de barrido luminoso no fibrado.