Procedimiento y sistema de detección de un tipo seleccionado de moléculas en una muestra.

Procedimiento de detección de un tipo seleccionado de moléculas o sustancia en una muestra quecomprende las etapas de:

a) poner en contacto la superficie receptora de un elemento micromecánico con la muestra, estandodispuesta dicha superficie receptora para interactuar con dichas moléculas o sustancia cuando dichasmoléculas o sustancia están presentes en dicha muestra, estando dispuesto el elemento micromecánico demodo que al menos una característica mecánica detectable de dicho elemento cambia cuando dichasuperficie receptora interactúa con dichas moléculas o sustancia;

b) medir dicha característica mecánica para obtener datos referidos a dicha característica mecánica;

c) determinar, en base a dichos datos, si la muestra contiene dicho tipo de moléculas o sustancia;

en el queal menos una condición a la que al menos la superficie receptora del elemento micromecánico está sometida, sevaría, con lo que dicha característica mecánica se mide una pluralidad de veces, de modo que los datos referidos adicha característica mecánica se obtienen para diferentes valores de dicha condición, con lo que la relación entredichos datos y dichos valores de la condición son usados para determinar si la muestra contiene dicho tipo demoléculas o sustancia o para determinar si existen fenómenos asociativos entre la superficie receptora y lasmoléculas o sustancia detectadas,

en el que dicha característica mecánica es seleccionada de entre la curvatura de una porción del elementomicromecánico, la posición de una porción del elemento micromecánico, al menos una característica de vibracióndel elemento micromecánico o tensión superficial en una porción del elemento mecánico, en el que dichas moléculasson moléculas de ácidos nucleicos y proteínas o péptidos y dichas sustancias son células eucariotas, bacterias, viruso viroides,

y en el que

dicha condición es al menos humedad o humedad relativa.

Procedimiento y sistema de detección de un tipo seleccionado de moléculas en una muestra Campo de la invención La presente invención se refiere al campo del análisis químico y/o biológico y a la detección mediante el uso de estructuras micro-o nanomecánicas, tales como micro-y nanovoladizos, micro-y nanopuentes, micro-o nanomembranas, etc.

Estado de la técnica

Existe un creciente interés por los sistemas y procedimientos a base de elementos nano-y micromecánicos: [H. G. Craighead, “Nanoelectromechanical systems”, Science 290, pp. 1532-1535 (2000) y M. Li, H. X. Tang, M. L. Roukes, ”Ultra-sensitive NEMS-based cantilevers for sensing, scanned probe and ver y high-frequency applications”, Nature Nanotechnology 2, pp. 114-120 (2007) ]. Los sistemas micro-y nanomecánicos (MMS) y los dispositivos basados en microvoladizos son dos ejemplos significativos de este tipo de sistemas.

Por ejemplo, los microvoladizos pueden usarse como sensores nanomecánicos, biológicos y químicos ultrasensibles: [B. Ilic, D. Czaplewski, H.G. Craighead, P. Neuzil, C. Campagnolo y C. Batt “Mechanical resonant immunospecific biological detector”, Applied Physics Letters 77, páginas 450-452 (2000) ]. La medición en tiempo real de la forma, el perfil, movimiento, tensión y/o deformación es muy útil para monitorizar la respuesta mecánica de, por ejemplo, sensores biológicos y químicos basados en la forma, el perfil, el movimiento, la tensión o la deformación de MMS o de micro-o nanovoladizos.

Los sistemas MMS y de microvoladizos incluyen sistemas a base de voladizos que poseen un extremo fijo y otro móvil; en estos sistemas, lo que se detecta habitualmente es el desplazamiento y/o movimiento del extremo “libre”. Sin embargo, también existen sistemas basados en voladizos sujetos con abrazaderas en ambos extremos, en los que se detecta el movimiento de la parte central. Además, existen otras estructuras micro-y nanomecánicas que son móviles y flexibles, tales como paletas sujetas por dos abrazaderas cuya dirección de movimiento “fácil” corresponde a la torsión de la paleta situada alrededor del eje de las bisagras que unen la paleta a un marco (básicamente, como una raqueta cuadrada fijada a un marco mediante dos asas opuestas de dicha raqueta que se extienden a lo largo del eje) . Otros sistemas conocidos usan membranas que se unen a un marco mediante dos conjuntos de bisagras, lo que permite dos grados angulares de libertad.

En sensores biológicos/químicos a base de SMM y microvoladizos, la superficie del elemento micro-o nanomecánico se sensibiliza con unas moléculas receptoras o “sonda” que reconocen selectivamente la sustancia diana. La interacción entre la sonda inmovilizada y la sustancia diana en la superficie del elemento micro-o nanomecánico produce un cambio en la forma, el perfil, la deformación, la tensión y el movimiento (vibración) del elemento mecánico. Por ejemplo, Stachowiak J. C. y col. divulgan como cambia la tensión de superficie de un microvoladizo después de hibridación de ADN (Langmuir 2006, 22: 263-268) . El seguimiento de este cambio se realiza habitualmente midiendo el desplazamiento de una parte representativa del elemento mecánico (habitualmente el extremo libre de un microvoladizo sujeto con una sola abrazadera, aunque también puede ser el centro de un microvoladizo sujeto con dos abrazaderas, una parte de una lámina de membrana, etc.) . Este desplazamiento puede encontrarse en el orden de aproximadamente 1-100 nanómetros (nm) y, en muchos casos, es necesario obtener una resolución mejor que 1 nm, dependiendo de la aplicación. Existen varias técnicas de lectura para el desplazamiento, tales como: la detección capacitiva, la detección a base de corriente por efecto túnel, la interferometría óptica, la lectura piezorresistiva y la técnica por deflexión de haz óptico.

Se divulgan ejemplos de sistemas de MMS y microvoladizo en, por ejemplo:

Engel y col., “Atomic force microscopy: a powerful tool to observe biomolecules at work”, Trends in Cell Biology, Volumen 9, páginas 77-80 (1999)

P. Vettiger y col., “The millipede-more than one thousand tips for future AFM storage”, IBM J. Res. Develop., Volumen 44, Número 3, páginas 323-339 (2000) .

Documento WO-A-2001/33226

Documento WO-A-2003/091458

Documento WO-A-2005/086172

Documento WO-A-2007/006834

El procedimiento por deflexión de haz óptico es quizá el más sensible y tiene la ventaja de que puede realizarse fácilmente. La figura 1 ilustra esquemáticamente una disposición de la técnica anterior convencional para la deflexión de haces ópticos. Una fuente de luz (tal como una fuente de láser) genera un haz de luz (tal como un haz de luz láser, en el espectro visible, ultravioleta o infrarrojo) que se enfoca (es decir, se enfoca bien directamente o

bien mediante medios de enfoque que implican uno o más espejos, etc.) en la parte del elemento mecánico en la que se va a medir el desplazamiento, por ejemplo en el extremo de un microvoladizo que forma parte del dispositivo micromecánico. La deflexión del haz reflejado en el microvoladizo se mide con un detector sensible a la posición (tal como un fotodetector, por ejemplo un fotodetector segmentado, un fotodetector sensible a la posición en continuo, una serie de fotodetectores, una CCD, etc.) . Por ejemplo, puede usarse un fotodetector segmentado que está dividido en dos segmentos. La deflexión del voladizo produce un desplazamiento del punto de láser reflejado en el fotodetector. Por lo tanto, la diferencia de fotocorrientes entre los dos segmentos es proporcional a la deflexión del voladizo. De modo similar, la técnica de deflexión de haz óptico puede aplicarse a otros tipos de elementos mecánicos tales como: voladizos sujetos con dos abrazaderas, láminas de membrana, micropaletas, etc. También puede aplicarse en la lectura de otros tipos de desplazamiento en lugar del desplazamiento fuera del plano, tales como el movimiento de torsión de microvoladizos y micropaletas, etc. (G. Meyer y N.M. Amer, “Simultaneous measurement of lateral and normal forces with an opticalbeam-deflection atomic force microscope”, Applied Physics Letters, vol. 57, páginas 2089-2091 (1990) ) .

Este sistema es adecuado para medir tanto el comportamiento estático como el dinámico de elementos mecánicos tales como voladizos, por ejemplo la deflexión máxima, el valor medio de deflexión, la amplitud en una frecuencia de referencia (el elemento puede manejarse desde el exterior mediante una fuerza de excitación que oscila a la frecuencia de referencia) , la fase del movimiento con respecto a una señal conductora externa, la frecuencia etc. El desplazamiento estático medido, la amplitud, la frecuencia, etc., pueden relacionarse después con el objeto que se va a medir y que interactúa con el voladizo, y con señales y/o procedimientos usados para estimular el objeto y/o el voladizo.

Ahora bien, la técnica descrita anteriormente es práctica cuando se desea medir el desplazamiento/movimiento de una única parte de un único elemento mecánico. Sin embargo, esta técnica no puede aplicarse en dispositivos basados en series que comprenden una pluralidad de elementos mecánicos, en los que es preciso medir el desplazamiento/movimiento de cada elemento. Estos dispositivos proporcionan la posibilidad de realizar varias funciones y más velocidad y/o información más completa que los dispositivos a base de un único elemento mecánico. Por ejemplo, los sensores químicos y biológicos a base de series de microvoladizos pueden detectar varias sustancias sensibilizando cada voladizo con un receptor diferente [R. McKendr y R y col., “Multiple label-free biodetection and quantitative DNA-binding assays on a nanomechanical cantilever array”, Proceedings of the National Academy Of Sciences of the United States Of America 99, pp. 9783-9788, 2002) ]. Además, puede ser ventajoso obtener más información sobre el desplazamiento de varias regiones del elemento mecánico, a fin de obtener más información sobre el estímulo externo objeto de la medición o sobre diferentes estímulos que interactúan con diferentes partes del elemento mecánico.

La solicitud de patente WO-A-2005/086172, mencionada anteriormente, divulga un sistema tal como el representado en la figura 2, en el que los microvoladizos de una serie están iluminadas por una única fuente de luz láser dispuesta en un actuador de una bobina móvil unidimensional, con lo que el haz de láser incidente está preparado para explorar periódicamente la serie en una dirección perpendicular a los ejes longitudinales de los microvoladizos. De este modo, el extremo... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de detección de un tipo seleccionado de moléculas o sustancia en una muestra que comprende las etapas de:

a) poner en contacto la superficie receptora de un elemento micromecánico con la muestra, estando dispuesta dicha superficie receptora para interactuar con dichas moléculas o sustancia cuando dichas moléculas o sustancia están presentes en dicha muestra, estando dispuesto el elemento micromecánico de modo que al menos una característica mecánica detectable de dicho elemento cambia cuando dicha superficie receptora interactúa con dichas moléculas o sustancia;

b) medir dicha característica mecánica para obtener datos referidos a dicha característica mecánica;

c) determinar, en base a dichos datos, si la muestra contiene dicho tipo de moléculas o sustancia;

en el que al menos una condición a la que al menos la superficie receptora del elemento micromecánico está sometida, se varía, con lo que dicha característica mecánica se mide una pluralidad de veces, de modo que los datos referidos a dicha característica mecánica se obtienen para diferentes valores de dicha condición, con lo que la relación entre dichos datos y dichos valores de la condición son usados para determinar si la muestra contiene dicho tipo de moléculas o sustancia o para determinar si existen fenómenos asociativos entre la superficie receptora y las moléculas o sustancia detectadas,

en el que dicha característica mecánica es seleccionada de entre la curvatura de una porción del elemento micromecánico, la posición de una porción del elemento micromecánico, al menos una característica de vibración del elemento micromecánico o tensión superficial en una porción del elemento mecánico, en el que dichas moléculas son moléculas de ácidos nucleicos y proteínas o péptidos y dichas sustancias son células eucariotas, bacterias, virus o viroides,

y en el que dicha condición es al menos humedad o humedad relativa.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha condición es solo humedad o humedad relativa, de modo que se varía la humedad a la que se somete la superficie receptora del elemento micromecánico, con lo que dicha característica mecánica se mide para distintos valores de la humedad, de modo que los datos referidos a dicha característica mecánica se obtienen para diferentes niveles de humedad, con lo que la relación entre dichos datos y dichos niveles de humedad se usa para determinar si la muestra contiene dicho tipo de moléculas o sustancia.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el elemento micromecánico es un microvoladizo, siendo una superficie de dicho microvoladizo la superficie receptora.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el fenómeno asociativo determinado es un fenómeno de hibridación ADN-ADN, una hibridación ADN-APN, una hibridación ADN-ARN, una hibridación APN-ARN, una interacción anticuerpo-antígeno que implica un anticuerpo policlonal o monoclonal, una interacción aptámero-ligando, una interacción enzima-sustrato, una interacción ribozima-sustrato, una interacción proteína-ligando, un fenómeno de adhesión célula-célula, un fenómeno de adhesión virus-célula, un fenómeno de adhesión viroide-célula o un fenómeno de adhesión bacteria-célula eucariota.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el fenómeno asociativo determinado es un fenómeno de hibridación de ADN caracterizado porque contiene uno o más desapareamientos de nucleótidos entre la sonda y la diana.

6. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el fenómeno asociativo determinado es un fenómeno anticuerpo-antígeno que consiste en una asociación anticuerpo-epítopo.

7. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicho microvoladizo es parte de una serie de microvoladizos, realizándose el procedimiento en dicha serie de microvoladizos para detectar la presencia de una pluralidad de diferentes tipos de moléculas en la muestra, estando asociados dichos diferentes tipos de moléculas con diferentes microvoladizos de dicha serie de microvoladizos.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de medición de la característica mecánica comprende dirigir un haz de luz contra una superficie de dicho elemento micromecánico, que recibe un haz de luz reflejado por dicho elemento micromecánico con un detector sensible a la posición (2) dispuesto para producir al menos una señal de salida en respuesta a la recepción de dicho haz de luz.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que además de la humedad o la humedad relativa se varía otra condición seleccionada entre el pH y la fuerza iónica del fluido en el que está

dispuesto el elemento micromecánico, el contenido relativo de una mezcla de gases o líquidos en la que está dispuesto el elemento micromecánico, la radiación a la que se somete la superficie receptora, el campo eléctrico o el campo magnético.