Procedimiento para la replicación de virus de la gripe en cultivo celular y los virus de la gripe que pueden obtenerse por el procedimiento.

Un procedimiento para hacer una vacuna para administración a humanos o animales que comprende:



a) la replicación de virus de la gripe en cultivo celular, en el que las células que pueden ser infectadas por virus de la gripe se cultivan en cultivo celular en suspensión en medio libre de suero, las células se infectan con virus de influencia y después de la infección se cultivan a una temperatura en el intervalo de 32º C a 34º C para la replicación del virus, en donde una proteasa es añadida a las células cultivadas antes, durante o después de la infección con virus de la gripe;

b) la recogida y el aislamiento de los virus de gripe replicados de 2 a 10 días después de la infección, en la que las células o residuos celulares son separados del medio de cultivo; y

c) la formulación de los virus de la gripe replicados para dar la vacuna, en donde:

la infecciosidad de los virus replicados se destruye por medio de métodos químicos y/o físicos o

los virus están presentes en la vacuna como virus atenuados vivos.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E09011476.

Solicitante: NOVARTIS VACCINES AND DIAGNOSTICS GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: EMIL-VON-BEHRING-STRASSE 76 35041 MARBURG ALEMANIA.

Inventor/es: GRONER, ALBRECHT, DR., VORLOP,JURGEN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K38/48 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › que actúan sobre enlaces peptídicos (3.4).
  • A61K39/145 A61K […] › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Orthomyxoviridae, p. ej. virus de la influenza.
  • C12N5/02 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Propagación de células individuales o de células en suspensión; Su conservación; Medios de cultivo para este fin.
  • C12N5/06
  • C12N7/00 C12N […] › Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los contienen; Su preparación o purificación (preparaciones de uso médico que contienen virus A61K 35/76; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos virales, p. ej. vacunas virales, A61K 39/00).
  • C12N7/01 C12N […] › C12N 7/00 Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los contienen; Su preparación o purificación (preparaciones de uso médico que contienen virus A61K 35/76; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos virales, p. ej. vacunas virales, A61K 39/00). › Virus, p. ej. Bacteriófagos, modificados por la introducción de material genético externo (vectores C12N 15/00).
  • C12N7/02 C12N 7/00 […] › Aislamiento o purificación.
  • G01N33/569 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus.

PDF original: ES-2435726_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Procedimiento para la replicación de virus de la gripe en cultivo celular y los virus de la gripe que pueden obtenerse por el procedimiento.

La presente invención se refiere a un procedimiento para hacer una vacuna para administración a humanos o animales en cultivo celular en suspensión a una temperatura en el intervalo de 32º C a 34º C.

Mancini y col. (Rev. Farm. Bloquím. Univ. Sao Paulo, Vol. 29 (2) 1993; 89-95) desvela experimentos en los que se evaluó la diferencia de tripsina en la multiplicación de virus de la gripe en células MDCK. En estos experimentos las células que son cultivadas adherentemente se incubaron a 35 ºC después de que se añadiera el virus de la gripe.

Todas las vacunas de la gripe que se han usado desde los años 40 hasta la actualidad como vacunas permitidas para el tratamiento de seres humanos y animales consisten en una o más cepas del virus que se han replicado en huevos de gallina embrionados. Estos virus se aislaron del fluido alantoideo de huevos de gallina infectados y se usan sus antígenos como vacuna como partículas del virus intactas o como partículas del virus disgregadas por detergentes y/o disolventes, denominada vacuna escindida, o como proteínas del virus definidas aisladas, denominada vacuna de subunidad. En todas las vacunas permitidas, los virus se inactivan por procedimientos conocidos por el experto en la materia. Incluso la replicación de virus atenuados vivos, que se ensaya en vacunas experimentales, se lleva a cabo en huevos de gallina embrionados.

El uso de huevos de gallina embrionados para producción de vacunas es costoso, laborioso y consume tiempo. Los huevos, de poblaciones sanas de gallinas controladas por veterinarios, deben incubarse antes de la infección, habitualmente durante 12 días. Antes de la infección, los huevos tienen que seleccionarse con respecto a embriones vivos, puesto que solo estos huevos son adecuados para replicación del virus. Después de la infección los huevos se incuban de nuevo, habitualmente durante 2 a 3 días. Los embriones aun vivos en este momento se sacrifican por frío y el fluido alantoideo se obtiene después a partir de los huevos individuales por aspiración. Por medio de procedimientos de purificación laboriosos, se separan sustancias del huevo de la gallina que conducen a efectos secundarios no deseados de los virus y se concentran los virus. Puesto que los huevos no son estériles (sin patógenos) , es necesario adicionalmente retirar y/o inactivar pirógenos y todos los patógenos que posiblemente están presentes. Para aumentar la producción de virus, la replicación de los virus de la gripe en los huevos de gallina como norma se lleva a cabo a temperaturas reducidas (aproximadamente 34 ºC) . Incluso los virus que provocan enfermedades respiratorias pueden replicarse en cultivo celular. Aquí también, en algunos casos, se emplean temperaturas reducidas (aproximadamente de 33 ºC) , que, sin embargo, no tienen efecto en la calidad de una vacuna que pueda obtenerse, sino que favorecen únicamente la replicación.

Pueden replicarse virus de otras vacunas tales como, por ejemplo, virus de la rabia, virus de las paperas, sarampión y rubéola, virus de la polio y virus de FSME en cultivos celulares. Puesto que los cultivos celulares que se originan de bancos celulares ensayados están sin patógenos y, a diferencia de los huevos de gallina, son un sistema de replicación de virus definido que (teóricamente) está disponible en cantidades casi ilimitadas, hacen posible una replicación de virus económica en ciertas circunstancias incluso en el caso de virus de la gripe. La producción de vacuna económica se consigue también posiblemente en tanto que el aislamiento y purificación del virus de un medio de cultivo celular estéril definido parece más sencilla que del fluido alantoideo que contiene proteína en gran medida.

El aislamiento y replicación de virus de la gripe en huevos conduce a una selección de ciertos fenotipos, la mayoría de los cuales difiere del aislado clínico. A diferencia de esto está el aislamiento y replicación de los virus en cultivo celular, en el que no se produce selección dependiente de pase (Oxford, J.S. y col., J. Gen. Virology 72 (1991) , 185 189; Robertson, J.S. y col., J. Gen. Virology 74 (1993) 2047 - 2051) . Para una vacuna eficaz, por lo tanto, la realización de virus en cultivo tisular también va a preferirse a partir de este aspecto que de huevos. Se sabe que los virus de la gripe pueden replicarse en cultivos celulares. Además de células embrionarias de gallinas y células de hámster (BHK 21- F Y HKCC) , células MDBK y en particular células MDCK se han descrito como células adecuadas para la replicación in Vitro de virus de la gripe (Kilbourne, E. D., en: Influenza, páginas 89 - 110, Plenum Medical Book Company- Nueva York y Londres, 1987) . Un prerrequisito para una infección exitosa es la adición de proteasas al medio de infección, preferentemente tripsina o serina proteasa similares, puesto que estas proteasas escinden extracelularmente la proteína precursora de hemaglutinina [HAo] a hemaglutinina activa [HA1 y HA2]. Solamente la hemaglutinina escindida conduce a la adsorción de los virus de la gripe en células con asimilación de virus posterior en la célula (Tobita, K. y col., Med. Microbiol. lmmunol., 162 (1975) , 9 - 14; Lazarowitz, S.G. & Choppin, p.w., Virology, 68 (1975) 440 - 454; Klenk, H. D. y col, . Virology 68 (1975) 426 - 439) Y de este modo a un ciclo de replicación adicional del virus en el cultivo celular.

La Patente US 4 500 513 describe la replicación de virus de la gripe en cultivos celulares en células que crecen de forma adherente. Después de la proliferación celular, el medio nutriente se retira y se añade medio nutriente fresco a las células, teniendo lugar la infección de las células con virus de la gripe simultáneamente o poco después. Un tiempo dado después de la infección, se añade proteasa (por ejemplo tripsina) para obtener una replicación de virus óptima. Los virus se recogen, purifican y procesan para proporcionar vacuna inactivada o atenuada. La replicación de virus de la gripe económica como un prerrequisito para la producción de vacunas no puede conseguirse, sin embargo, usando la metodología descrita en la patente mencionada, puesto que el cambio de medio, la infección posterior así como la adicción de tripsina que se lleva a cabo más tarde, necesitan que se abran los recipientes de cultivo celular individuales varias veces y es por lo tanto muy laboriosa. Además, aumenta el peligro de contaminación del cultivo celular por microorganismos no deseables y virus con cada manipulación de los recipientes de cultivo. Una alternativa más rentable es proliferación celular en sistemas fermentadores conocidos por el experto en la materia, creciendo las células de forma adherente en micro vehículos. El suero necesario para el crecimiento de las células en los micro vehículos (habitualmente suero de ternero fetal) , sin embargo, contiene inhibidores de tripsina, de modo que incluso en este procedimiento de producción es necesario un cambio de medio a medio sin suero para conseguir la escisión de la hemaglutinina de la gripe por tripsina y por lo tanto una replicación de virus adecuadamente alta. De este modo esta metodología también requiere la apertura de los recipientes de cultivo varias veces y por lo tanto trae consigo el aumento de peligro de contaminación.

La presente invención se basa por lo tanto en el objeto de realizar procedimientos disponibles que hagan posible una aplicación de virus de la gripe simple y económica en cultivo celular y conduzca a una vacuna altamente eficaz.

Este objeto se consigue por la provisión de las realizaciones indicadas en las reivindicaciones de la patente.

Se ha descubierto sorprendentemente que por la replicación de los virus de la gripe en células infectadas a temperaturas reducidas, se obtienen virus que tienen una eficacia sensiblemente superior como vacuna que los virus que se obtienen por replicación a 37 ºC. La replicación a 37 ºC, la temperatura usada habitualmente para la replicación de gripe en el cultivo celular, ciertamente conduce a rendimientos de virus comparativamente altos en un tiempo corto. Sin embargo, los virus introducidos de este modo tienen una eficacia baja como vacuna en comparación con virus que se preparan por el procedimiento de acuerdo con la invención.

Las células que se usan en el procedimiento de acuerdo con la invención para la replicación de virus de la gripe pueden ser en principio cualquier tipo deseado de células que pueden ser cultivadas en cultivo celular y que pueden ser infectadas por virus de la gripe. En una realización preferida, las células son células de vertebrados, en particular... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para hacer una vacuna para administración a humanos o animales que comprende:

a) la replicación de virus de la gripe en cultivo celular, en el que las células que pueden ser infectadas por virus de la gripe se cultivan en cultivo celular en suspensión en medio libre de suero, las células se infectan con virus de influencia y después de la infección se cultivan a una temperatura en el intervalo de 32º C a 34º C para la replicación del virus, en donde una proteasa es añadida a las células cultivadas antes, durante o después de la infección con virus de la gripe; b) la recogida y el aislamiento de los virus de gripe replicados de 2 a 10 días después de la infección, en la que las células o residuos celulares son separados del medio de cultivo; y c) la formulación de los virus de la gripe replicados para dar la vacuna, en donde:

la infecciosidad de los virus replicados se destruye por medio de métodos químicos y/o físicos o los virus están presentes en la vacuna como virus atenuados vivos

2. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1, en el que las células se cultivan con virus de la gripe a 33º C después de la infección para la replicación del virus.

3. El procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que las células son células de vertebrados.

4. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 3, en el que las células de vertebrados son células de ave.

5. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 4, en donde las células de ave son células de embrión de gallina.

6. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 3, en el que las células de vertebrado son células de mamífero.

7. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 6, en donde las células de mamífero son células de hámster, ganado, mono o perro.

8. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 7, en donde las células de mamífero son células BHK21-F, células HKCC, células VERO, o células MDCK.

9. El procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la proteasa es un proteasa serina.

10. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 9, en donde la proteasa serina es tripsina.

11. El procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la recogida y aislamiento de los virus de la gripe tiene lugar de 2 a 7 días después de la infección.


 

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