PROCEDIMIENTO PARA LA REDUCCIÓN ENZIMÁTICA ENANTIOSELECTIVA DE CETOCOMPUESTOS.

Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva a) de cetocompuestos de fórmula general I R1-C(O)-R2 (I) en la que R1 significa uno de los restos 1) -alquilo (C3-C20),

en el que el alquilo es de cadena lineal o ramificada, 2) -alquenilo (C2-C20), en el que el alquenilo es de cadena lineal o ramificada y contiene opcionalmente hasta cuatro dobles enlaces, 3) -alquinilo (C2-C20), en el que el alquinilo es de cadena lineal o ramificada y contiene opcionalmente hasta cuatro triples enlaces, 4) -arilo (C6-C14), 5) -alquil (C1-C8)-arilo (C6-C14), 6) -heterociclo (C5-C14), que no está sustituido o está mono, di o trisustituido con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, o 7) -cicloalquilo (C3-C7), no estando sustituidos los restos mencionados anteriormente en 1) a 7) o estando mono, di o trisustituidos independientemente entre sí con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, y R2 significa uno de los restos 8) -alquilo (C1-C6), en el que el alquilo es de cadena lineal o ramificada, 9) -alquenilo (C2-C6), en el que el alquenilo es de cadena lineal o ramificada y contiene opcionalmente hasta tres dobles enlaces, 10) -alquinilo (C2-C6), en el que el alquinilo es de cadena lineal o ramificada y contiene opcionalmente dos triples enlaces, o 11) -alquil (C1-C10)-C(O)-O-alquilo (C1-C6), en el que el alquilo es lineal o de cadena ramificada y no está sustituido o está mono, di o trisustituido con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, no estando sustituidos los restos mencionados anteriormente en 8) a 11) o estando mono, di o trisustituidos independientemente entre sí con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, b) de los cetocompuestos 4-cloroacetoacetato de etilo, acetoacetato de metilo, 4-hidroxi-2-butanona, piruvato de etilo, fenilglioxilato de etilo, 1,4-dicloro-2-butanona, 4-bromoacetoacetato de etilo, 1,1- dicloroacetona, 1,1,3-tricloroacetona, 1,1,1-trifluoroacetona, 1-cloroacetona o 2,5-hexanodiona caracterizado porque una mezcla líquida, bifásica, que contiene (a) al menos el 5% en peso/volumen de uno de los cetocompuestos mencionados anteriormente, (b) al menos el 10% en volumen de 4-metil-2-pentanol, 5-metil-2-hexanol y/o 2-heptanol y (c) agua, se trata con una oxidorreductasa en presencia de NAD(P)H como cofactor, para formar, para el caso (a), un hidroxicompuesto quiral de fórmula general II R1-CH(OH)-R2 (II), en la que R1 y R2 tienen los significados indicados anteriormente, y para formar, en el caso (b), un hidroxicompuesto quiral correspondiente

La presente invención se refiere a un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de cetocompuestos con carbonil reductasas.

Las carbonil reductasas (otros nombres: alcohol deshidrogenasas, oxidorreductasas) se conocen como catalizadores para la reducción de compuestos carbonílicos o para la oxidación de alcoholes secundarios. Estas enzimas necesitan una coenzima, por ejemplo NAD(P)H. La reducción de cetonas con la carbonil reductasa obtenida a partir de Lactobacillus kefir y la coenzima NADPH se conoce por ejemplo por el documento US

5.342.767. Con estas enzimas se logra reducir cetocompuestos dando hidroxicompuestos ópticamente activos. Un procedimiento adicional se conoce por ejemplo por el documento WO 03/078615.

Los hidroxicompuestos ópticamente activos son elementos estructurales quirales valiosos con amplia aplicación para la síntesis de compuestos farmacológicamente eficaces, sustancias aromáticas, feromonas, productos agroquímicos e inhibidores enzimáticos. A este respecto, en particular en la industria farmacéutica existe una demanda creciente de compuestos quirales y por consiguiente de registrar tecnologías de síntesis quiral, dado que en el futuro apenas se usarán compuestos racémicos como fármacos.

La reducción asimétrica de cetocompuestos proquirales es un sector de la catálisis estereoselectiva al representar la biocatálisis una tecnología de competencia eficaz para la catálisis química. La hidrogenación asimétrica química requiere la utilización de catalizadores de metales pesados altamente tóxicos y contaminantes, de condiciones de reacción extremas y por consiguiente de alta energía así como grandes cantidades de disolventes orgánicos. Además, estos procedimientos se caracterizan con frecuencia por reacciones secundarias y excesos enantioméricos insuficientes.

Las reducciones de cetocompuestos proquirales para dar hidroxicompuestos y a la inversa se producen en la naturaleza en numerosas rutas bioquímicas, tanto en el metabolismo primario como en el metabolismo secundario, en cada organismo y se catalizan por diferentes tipos de oxidorreductasas y alcohol secundario deshidrogenasas. Por regla general, estas enzimas dependen del cofactor.

La principal factibilidad de la utilización de biocatalizadores para la reducción de cetocompuestos proquirales para dar hidroxicompuestos quirales se demostró en el pasado repetidas veces por medio de sistemas de modelización, en los que se trabajó tanto con oxidorreductasas aisladas como con diferentes sistemas de biotransformación de células completas. El planteamiento biocatalítico es ventajoso en cuanto a las condiciones de reacción suaves, la ausencia de productos secundarios y con frecuencia excesos enantioméricos alcanzables esencialmente mejores. A este respecto, el uso de enzimas aisladas lleva ventaja con respecto al procedimiento con células completas en cuanto al exceso enantiomérico alcanzable, a la generación de productos secundarios y de degradación así como en cuanto al aislamiento de los productos. Además, el uso de procesos de células completas no es posible en todas las operaciones químicas, dado que para ello son necesarios equipamiento y conocimientos especiales.

Recientemente pudo mostrarse que el uso de oxidorreductasas aisladas en sistemas bifásicos acuosos/orgánicos con disolventes orgánicos es posible de manera extraordinariamente eficaz y también a altas concentraciones (>5%). En el caso de los sistemas descritos, a este respecto, el cetocompuesto que debe reducirse, la mayoría de las veces escasamente soluble en agua, forma la fase orgánica junto con el disolvente orgánico. También puede renunciarse en parte al propio disolvente orgánico, entonces la fase orgánica se forma a partir del cetocompuesto que debe reducirse (documentos DE10119274, DE10327454.4, DE 103 37 401.9, DE 103 00 335.5). La regeneración de coenzima se realiza a este respecto mediante la oxidación simultánea de alcoholes secundarios, usándose en la mayoría de los casos el barato 2-propanol miscible con agua.

Ejemplos de deshidrogenasas y oxidorreductasas específicas de R y S adecuadas de alta enantioselectividad son:

Carbonil reductasa de Candida parapsilosis (CPCR) (documentos US 5.523.223 y US 5.763.236, (Enzyme Microb Technol. noviembre de 1993; 15(11):950-8)) o ADH de Pichia capsulata (documento DE10327454.4);

Carbonil reductasa de Rhodococcus erythropolis (RECR) (documento US 5.523.223), Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (10) (1999), páginas 1721-1729), (Appl Microbiol Biotechnol. septiembre de 2003; 62(4):380-6. Publicación electrónica del 26 de abril de 2003) y Rhodococcus ruber (J Org Chem. 24 de enero de 2003; 68(2):402-6.);

y

alcohol secundario deshidrogenasas específicas de R de organismos del género Lactobacillus (Lactobacillus kefir (documento US5200335), Lactobacillus brevis (documento DE 19610984 A1) (Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. diciembre de 2000; 56 Pt 12: 1696-8), Lactobacillus minor (documento DE10119274) o Pseudomonas (documento US 05385833) (Appl Microbiol Biotechnol. agosto de 2002; 59(4-5):483-7. Publicación electrónica del 26 de junio de 2002. J. Org. Chem. 1992, 57, 1532).

El documento WO 2005/108593 A describe un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de 2-butanona para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, haciéndose reaccionar el cetocompuesto en una mezcla líquida, bifásica, que contiene 2-butanona, 4-metil-2-pentanol o 2-heptanol y agua, con una oxidorreductasa de Candida parapsilosis en presencia de NAD como cofactor.

En el documento WO 03/078615 A se describen alcohol deshidrogenasas así como un procedimiento de reducción enzimática enantioselectiva de cetocompuestos con el uso de estas enzimas, en el que se realiza la reducción con una oxidorreductasa en presencia de por ejemplo NADH. Como cosustrato se utilizan alcoholes secundarios tales como isopropanol o 4-metil-2-propanol.

En los procedimientos del estado de la técnica existe la necesidad de mejorar o simplificar la regeneración de coenzima. La mayoría de las alcohol deshidrogenasas y oxidorreductasas se inactivan rápidamente a una concentración de propanol de >15% en volumen, lo que conduce a que éste no pueda utilizarse en procedimientos discontinuos en cualquier exceso para dar un cetocompuesto, por lo cual a igual concentración de cetocompuesto en el caso de sustratos con una posición de equilibrio desfavorable, sólo pueden alcanzarse rendimientos poco satisfactorios.

La invención se plantea el objetivo de eliminar este inconveniente.

El procedimiento según la invención para la reducción enzimática enantioselectiva de

a) cetocompuestos de fórmula general I

R1-C(O)-R2 (I)

en la que R1 significa uno de los restos

1) -alquilo (C3-C20), en el que el alquilo es de cadena lineal o ramificada,

2) -alquenilo (C2-C20), en el que el alquenilo es de cadena lineal o ramificada y contiene opcionalmente hasta cuatro dobles enlaces,

3) -alquinilo (C2-C20), en el que el alquinilo es de cadena lineal o ramificada y contiene opcionalmente hasta cuatro triples enlaces,

4) -arilo (C6-C14),

5) -alquil (C1-C8)-arilo (C6-C14), 6) -heterociclo (C5-C14), que no está sustituido o está mono, di o trisustituido con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, o 7) -cicloalquilo (C3-C7), no estando sustituidos los restos mencionados anteriormente en 1) a 7) o estando mono, di o trisustituidos

independientemente entre sí con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, y R2 significa uno de los restos 8) -alquilo (C1-C6), en el que el alquilo es de cadena lineal o ramificada, 9) -alquenilo (C2-C6), en el que el alquenilo es de cadena lineal o ramificada y contiene opcionalmente hasta tres

dobles enlaces,

10) -alquinilo (C2-C6), en el que el alquinilo es de cadena lineal o ramificada y contiene opcionalmente dos triples enlaces, o 11) -alquil (C1-C10)-C(O)-O-alquilo (C1-C6), en el que el alquilo es lineal o de cadena ramificada y no está sustituido

o está mono, di o trisustituido con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2,

no estando sustituidos los restos mencionados anteriormente en 8) a 11) o estando mono, di o trisustituidos con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2,

b) de los cetocompuestos 4-cloroacetoacetato de etilo, acetoacetato de metilo, 4-hidroxi-2-butanona,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva a) de cetocompuestos de fórmula general I

R1-C(O)-R2 (I)

en la que R1 significa uno de los restos

1) -alquilo (C3-C20), en el que el alquilo es de cadena lineal o ramificada,

2) -alquenilo (C2-C20), en el que el alquenilo es de cadena lineal o ramificada y contiene

opcionalmente hasta cuatro dobles enlaces,

3) -alquinilo (C2-C20), en el que el alquinilo es de cadena lineal o ramificada y contiene opcionalmente

hasta cuatro triples enlaces,

4) -arilo (C6-C14),

5) -alquil (C1-C8)-arilo (C6-C14),

6) -heterociclo (C5-C14), que no está sustituido o está mono, di o trisustituido con -OH, halógeno, -NO2

y/o -NH2, o 7) -cicloalquilo (C3-C7), no estando sustituidos los restos mencionados anteriormente en 1) a 7) o estando mono, di o trisustituidos

independientemente entre sí con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, y R2 significa uno de los restos 8) -alquilo (C1-C6), en el que el alquilo es de cadena lineal o ramificada, 9) -alquenilo (C2-C6), en el que el alquenilo es de cadena lineal o ramificada y contiene opcionalmente

hasta tres dobles enlaces,

10) -alquinilo (C2-C6), en el que el alquinilo es de cadena lineal o ramificada y contiene opcionalmente dos triples enlaces, o 11) -alquil (C1-C10)-C(O)-O-alquilo (C1-C6), en el que el alquilo es lineal o de cadena ramificada y no

está sustituido o está mono, di o trisustituido con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2,

no estando sustituidos los restos mencionados anteriormente en 8) a 11) o estando mono, di o trisustituidos independientemente entre sí con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, b) de los cetocompuestos 4-cloroacetoacetato de etilo, acetoacetato de metilo, 4-hidroxi-2-butanona,

piruvato de etilo, fenilglioxilato de etilo, 1,4-dicloro-2-butanona, 4-bromoacetoacetato de etilo, 1,1dicloroacetona, 1,1,3-tricloroacetona, 1,1,1-trifluoroacetona, 1-cloroacetona o 2,5-hexanodiona caracterizado porque una mezcla líquida, bifásica, que contiene

(a) al menos el 5% en peso/volumen de uno de los cetocompuestos mencionados anteriormente,

(b) al menos el 10% en volumen de 4-metil-2-pentanol, 5-metil-2-hexanol y/o 2-heptanol y

(c) agua, se trata con una oxidorreductasa en presencia de NAD(P)H como cofactor, para formar, para el caso (a), un hidroxicompuesto quiral de fórmula general II R1-CH(OH)-R2 (II),

en la que R1 y R2 tienen los significados indicados anteriormente, y para formar, en el caso (b), un hidroxicompuesto quiral correspondiente.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la oxidorreductasa es de origen microbiano.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la oxidorreductasa procede de bacterias del grupo Lactobacillales o de levaduras.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque la oxidorreductasa procede de bacterias del género Lactobacillus o de levaduras de los géneros Pichia, Candida, Pachysolen, Debaromyces o Issatchenkia.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la mezcla líquida, bifásica, en

5 el caso del uso de una oxidorreductasa de origen microbiano, contiene al menos el 40% en volumen de 4metil-2-pentanol, 5-metil-2-hexanol y/o 2-heptanol.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque la mezcla líquida, bifásica, contiene entre el 40 y el 80% en volumen de 4-metil-2-pentanol, 5-metil-2-hexanol y/o 2-heptanol.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la mezcla líquida, bifásica, 10 contiene uno de los cetocompuestos mencionados anteriormente entre el 2 y el 50% en peso/volumen.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque la mezcla líquida, bifásica, contiene uno de los cetocompuestos mencionados anteriormente entre el 10 y el 50% en peso/volumen.