Procedimiento para la purificación de ácido hialurónico de elevado peso molecular.

Un procedimiento para purificar ácido hialurónico (HA) o su sal a partir de un caldo de fermentación bacteriana,

que comprende:

(a) diluir y clarificar el caldo de fermentación;

(b) precipitar el HA presente en el caldo con volumen igual de disolvente;

(c) disolver el HA precipitado o su sal en una solución;

(d) añadir gel de sílice a la solución de HA o a la solución de sal de HA de la etapa (c) y después eliminar el gel de sílice;

(e) tratar la solución de HA o la solución de sal de HA de la etapa (d) con carbón activo; y

(f) diafiltrar la solución de HA o la solución de sal de HA de la etapa (e) usando aproximadamente 5 volúmenes 10 de disolvente;

en donde el procedimiento se realiza en ausencia de cualquier detergente o agente tensioactivo, o formalina, y a un pH neutro.

Procedimiento para la purificación de ácido hialurónico de elevado peso molecular.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas con la presente Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud india provisional nº 1065/MUM/2006 presentada el 6 de julio de 2006 y nº 1874/MUM/2006 presentada el 13 de noviembre de 2006.

Campo de la invención.

La presente invención se refiere a técnicas mejoradas para purificar ácido hialurónico y su sal. La presente invención se refiere también a la purificación del ácido hialurónico y su sal, que tienen aplicaciones biomédicas.

Fundamento de la invención El ácido hialurónico (HA) es un biopolímero presente en la naturaleza que tiene funciones biológicas en bacterias y animales superiores, incluyendo las personas. El HA de origen natural puede encontrarse en el tejido de animales superiores, en particular como relleno del espacio intercelular. (Balazs, Viscosupplementation: a new concept in the treatment of osteoarthritis. J. Rheumatol. Suppl.; 39: 3-9, (Agosto 1993) ) . Se encuentra en las más altas concentraciones en el humor vítreo del ojo y en el líquido sinovial de las articulaciones. (O'Regan, M., Martini, I., Crescenzi, F., De Luca; C., y Lansing, M., Molecular mechanisms and genetics of hialuronano biosynthesis. International Journal of Biological Macromolecules 16: 283-286 (1994) ) . En estreptococos gram-positivos, se encuentra como cápsula mucoide que rodea la bacteria.

El ácido hialurónico, llamado también hialuronano o hialuronato, es un glicosaminoglicano distribuido extensamente por los tejidos conjuntivo, epitelial y neuronal. Es uno de los principales componentes de la matriz extracelular. Contribuye de manera significativa a la proliferación y a la migración de las células, y puede intervenir también en el progreso de algunos tumores malignos. El hialuronano se encuentra de forma natural en muchos tejidos del cuerpo, tales como piel, cartílago y humor vítreo. Es por tanto muy adecuado para aplicaciones médicas dirigidas a esos tejidos. El primer producto médico de hialuronano, el Healon®, fue desarrollado en los años 70 y 80, y su uso fue aprobado para la cirugía ocular (es decir, trasplante de córnea, cirugía de cataratas, cirugía del glaucoma y cirugía reparadora del desprendimiento de retina) . Otras compañías biomédicas producen también marcas de hialuronano para cirugía oftalmológica.

El hialuronano se usa también para tratar la osteoartritis de la rodilla. Tales tratamientos se administran como grupo de inyecciones en la articulación de la rodilla y pueden actuar para suplementar la viscosidad del líquido de la articulación lubricando de esta forma dicha articulación, amortiguándola y produciendo un efecto analgésico. El hialuronano puede tener también efectos bioquímicos positivos sobre las células del cartílago.

Debido a su elevada biocompatibilidad y su presencia común en la matriz extracelular de los tejidos, el hialuronano está ganando popularidad como biomaterial de andamiaje en la investigación de la ingeniería de tejidos. En algunos cánceres, los niveles de hialuronano se correlacionan bien con la malignidad y el mal pronóstico. El hialuronano puede ser usado como marcador tumoral para el cáncer de próstata y de mama. También puede ser usado para controlar el progreso de estas enfermedades.

El hialuronano puede usarse también postoperatoriamente para inducir la cicatrización de los tejidos, sobre todo después de la cirugía de cataratas. Los modelos actuales de cicatrización de heridas proponen que los polímeros mayores del ácido hialurónico aparecen en las primeras fases de la cicatrización para hacer espacio físicamente para los glóbulos blancos que median en la respuesta inmunitaria. El hialuronano es un ingrediente común en los productos para el cuidado de la piel.

El término “hialuronato” se refiere a la base de conjugado de ácido hialurónico (HA) . Debido a que, in vivo, la molécula existe típicamente en su forma polianiónica, es más habitual denominarlo “hialuronano”. El HA está formado por unidades de disacárido polianiónico lineal, no ramificado, que consisten en ácido glucurónico (GlcUA) una N-acetil glucosamina (GlcNAc) unida alternativamente por enlaces glicosídicos beta 1-3 y beta 1-4, como se muestra en la Figura 1. El HA es un miembro de la familia del glicosaminoglicano, que incluye sulfato de condroitina, sulfato de dermatina y sulfato de heparano. A diferencia de otros miembros de esta familia, no se une covalentemente a las proteínas.

En una solución acuosa neutra, debido a la formación de enlaces de hidrógeno, las moléculas de agua y los grupos carboxilo y N-acetilo adyacentes confieren una rigidez conformacional al polímero, lo que limita su flexibilidad. La formación de enlaces de hidrógeno tiene por resultado una capacidad de unión y retención de agua del polímero que resulta única. También se desprende que la capacidad ligante de agua está relacionada directamente con el peso molecular de la molécula. Se sabe que pueden unirse hasta seis litros de agua por gramo de HA (Sutherland, Novel and established applications of microbial polysacharides. Trends Biotechnol 16: 41 - 46, 1998) .

El ácido hialurónico (HA) y sus derivados han sido ampliamente estudiados en cuanto a sus aplicaciones en prácticas biomédicas. La característica de biocompatibilidad de este polímero ha llamado la atención en ortopedia ya que puede usarse en viscocirugía y permite a los cirujanos crear con seguridad espacio entre tejidos. Los implantes viscoquirúrgicos se construyen de HA (Balazs, Ag 1993, id.) . El carácter viscoelástico del HA ha sido usado para suplementar la lubricación en articulaciones artríticas. También se ha usado para el suministro como microcápsulas de fármacos direccionados. Finalmente, a causa de su elevada capacidad de retención de agua, este EPS (polisacárido extracelular) ocupa también un lugar en el provechoso mercado de los cosméticos. En 2003 el organismo FDA aprobó las inyecciones de hialuronano para rellenar defectos de tejido blando tales como las arrugas faciales. El Restylane® es un nombre comercial común para el producto. Las inyecciones de hialuronano suavizan temporalmente las arrugas añadiendo volumen bajo la piel, durando los efectos típicamente seis meses. Además, las soluciones de HA son característicamente viscoelásticas y pseudoplásticas. Estas características se encuentran incluso en soluciones muy diluidas de este polímero, en las que se forman geles muy viscosos. La propiedad viscoelástica de las soluciones de HA, que es importante para su uso como biomaterial, es controlada por la concentración y el peso molecular del HA. El peso molecular del HA procedente de distintas fuentes es muy variable y está en el intervalo de 104 a 107 Da. La extrusión del HA a través de la membrana de la célula tal como se produce permite el alargamiento del polímero sin restricciones, lo que puede tener por resultado un peso molecular del HA muy alto.

El peso molecular es un parámetro que es el que más afecta a las propiedades físicas de los dispositivos médicos basados en el ácido hialurónico. El peso molecular influye sobre los perfiles de la viscosidad frente a la concentración de las soluciones de ácido hialurónico, y desempeña un papel fundamental en sus otras propiedades viscoelásticas. En particular, las soluciones que requieren una viscosidad dada para su eficacia terapéutica, requieren concentraciones más bajas de ácido hialurónico si aumenta el peso molecular. Se ha demostrado que esto proporciona ventajas tanto en las aplicaciones oftalmológicas como en las ortopédicas. Por tanto, un proceso que es capaz de generar ácido hialurónico de calidad médica, que tiene un peso molecular mayor que 750.000 daltons, tiene un importante potencial comercial. En muchas aplicaciones farmacéuticas, no es deseable tener ácido hialurónico de bajo peso molecular en la formulación, por ejemplo teniendo en cuenta los efectos inflamatorios del HA de bajo peso molecular, como se publica en la patente de EE.UU. nº 4.141.973.

El ácido hialurónico se usa en productos comerciales de gran venta, entre los que se incluyen Synvisc (Genzyme) , Orthovisc (Anika) , Seprafilm (Genzyme) , Restylane (Q-Med) , Healon (Pharmacia) , Amvisc (Med-Chem) , etc. Debido a su elevado coste, sin embargo, se usa solamente en concentraciones muy pequeñas en estos productos. El HA tiene un valor comercial mayor que otros EPS microbianos. Con un valor estimado en el mercado de 500 millones de dólares USA, se vende a aproximadamente 100.000 dólares el kilogramo.

El HA se ha extraído convencionalmente de las crestas de gallo y del humor vítreo bovino. Sin embargo,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para purificar ácido hialurónico (HA) o su sal a partir de un caldo de fermentación bacteriana, que comprende:

(a) diluir y clarificar el caldo de fermentación;

(b) precipitar el HA presente en el caldo con volumen igual de disolvente;

(c) disolver el HA precipitado o su sal en una solución;

(d) añadir gel de sílice a la solución de HA o a la solución de sal de HA de la etapa (c) y después eliminar el gel de sílice;

(e) tratar la solución de HA o la solución de sal de HA de la etapa (d) con carbón activo; y

(f) diafiltrar la solución de HA o la solución de sal de HA de la etapa (e) usando aproximadamente 5 volúmenes de disolvente;

en donde el procedimiento se realiza en ausencia de cualquier detergente o agente tensioactivo, o formalina, y a un pH neutro.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el HA precipitado en la etapa (b) se convierte en su sal, y después se homogeneiza en la solución de la etapa (c) .

3. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que es válido uno de los apartados (i) , (ii) , (iii) y (iv) :

(i) la solución de la etapa (c) es acetato sódico al 3%;

(ii) el gel de sílice se elimina mediante centrifugación en la etapa (d) ;

(iii) el carbón activo es impregnado sobre un cartucho de celulosa en la etapa (e) ;

(iv) el disolvente de la etapa (f) es agua estéril libre de pirógenos.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el disolvente usado en la etapa (b) se elige entre isopropanol, etanol y acetona.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que el disolvente es isopropanol.

6. El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además:

(g) aislar el HA estéril purificado, o su sal, por filtración a través de un filtro aséptico; y

(h) liofilizar el HA, o su sal, hasta que el contenido de humedad es menor que 5%.

7. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el disolvente de la etapa (b) es isopropanol y el método comprende además (g) liofilizar el HA o su sal hasta que el contenido de humedad es menor que 5%.

8. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el caldo de fermentación se obtiene por un procedimiento que comprende:

(i) proporcionar una bacteria Streptococcus capaz de producir HA;

(ii) proporcionar un medio nutriente para cultivar la bacteria, en donde el medio nutriente comprende una sal de ion zinc divalente, 1% de hidrolizado de caseína, y 5% de una fuente de carbono elegida entre el grupo que consiste en lactosa y sacarosa;

(iii) cultivar la bacteria en el medio nutriente; y

(iv) fermentar el medio nutriente bajo condiciones aerobias, en donde el ácido hialurónico tiene un peso molecular de al menos 1 millón de Da.

9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que:

(a) la fermentación es continua;

(b) la sal del ion de zinc divalente es ZnSO4;

(c) la etapa de fermentación se realiza durante al menos 15 horas a una temperatura de 30 a 40°C, una velocidad de agitación de 300 a 500 rpm, una aireación de 1 a 3 vvm, y un pH neutro.

(d) el HA tiene un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 3, 5 x 106 Da a 4, 0 x 106 Da, y el procedimiento produce un rendimiento de al menos 5 g de HA de alto peso molecular por litro de medio nutriente; o

(e) la bacteria se elige entre el grupo consistente en Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus equi y Streptococcus pyogenes.

10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que la bacteria es Streptococcus zooepidemicus.

11. Un procedimiento según la reivindicación 1 para preparar un ácido hialurónico (HA) o su sal, que comprende:

(a) proporcionar una bacteria Streptococcus capaz de producir HA;

(b) proporcionar un medio nutriente para cultivar la fuente microbiana, en donde el medio nutriente comprende una sal de ion zinc divalente, hidrolizado de caseína al 1%, y una fuente de carbono al 5% elegida entre el grupo que consiste en lactosa y sacarosa;

(c) cultivar la bacteria en el medio nutriente;

(d) fermentar el medio nutriente bajo condiciones aerobias;

(e) diluir y clarificar el medio nutriente;

(f) precipitar el HA presente en el medio diluido con un disolvente;

(g) disolver el HA precipitado o su sal en una solución;

(h) añadir gel de sílice a la solución de HA o a la solución de sal de HA de la etapa (g) y después eliminar el gel de sílice;

(i) tratar la solución de HA o la solución de sal de HA de la etapa (h) con carbón activo; y

(j) diafiltrar la solución de HA o la solución de sal de HA de la etapa (i) usando un disolvente;

en donde el procedimiento se lleva a cabo en ausencia de cualquier detergente o agente tensioactivo, o formalina, y a un pH neutro; en donde el HA tiene un peso molecular de al menos 1 millón de Da.