PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR ALERGENO DE GRUPO I DE ACARO RECOMBINANTE MADURO.

Un procedimiento para producir alérgeno de Grupo I de Ácaro recombinante maduro que comprende las etapas de a) proporcionar un sistema de expresión de alérgeno en forma de una célula huésped seleccionada entre el grupo de levaduras que contienen un vector que comprende ADNc que codifica pro-alérgeno,

b) cultivar el sistema de expresión de alérgeno a un pH de cultivo de entre 5,5 y 7,5 durante un periodo de cultivo para expresar pro-alérgeno para obtener una mezcla de cultivo que contiene pro-alérgeno, c) ajustar el pH de la mezcla de cultivo hasta un pH de maduración de entre 3,5 y 5,0, d) mantener la mezcla de cultivo al pH de maduración durante un periodo de maduración para convertir el pro-alérgeno en alérgeno maduro para obtener una mezcla de producto, y e) someter la mezcla de producto a un procedimiento de purificación para aislar alérgeno maduro a partir de la mezcla de producto

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2008/063379.

Solicitante: ALK-ABELLO A/S.

Nacionalidad solicitante: Dinamarca.

Dirección: BÖGE ALLÉ 6-8 2970 HÖRSHOLM DINAMARCA.

Inventor/es: MONSALVE CLEMENTE,Rafael Ignacio, HERNANDEZ,Domingo Barber.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 7 de Octubre de 2008.

Clasificación PCT:

  • C07K14/435 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de animales; de humanos.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2370683_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Procedimiento para producir alérgeno de Grupo I de Ácaro recombinante maduro Campo técnico La presente invención se refiere a un procedimiento para producir alérgeno de Grupo I de Ácaro recombinante maduro. Antecedentes de la invención El documento WO 01/29078, Ejemplo 2, describe la producción de Derf 1 en Pichia Pastoris que comprende el cultivo en medio YPD a pH 6 para producir pro-Der f 1. El sobrenadante del medio de cultivo se recuperó y se diluyó con tampón pH 4,5 y se desarrolló en una columna de SP-Sefarosa equilibrada con tampón pH 4,5. La proteína se diluyó con tampón pH 4,5 con un gradiente de NaCl lineal en 20-25 volúmenes de columna. Este procedimiento produjo dos formas maduras de Der f 1, una que tiene dos aminoácidos adicionales en el extremo N terminal en comparación con el otro. Se afirma que P. pastoris es capaz de producir la pro-forma y escindirla para producir la forma madura. En el Ejemplo 12 del documento WO 01/29078 se especula que pro-Der f 1 experimenta autoprocesamiento y se preparó un mutante inactivo que tiene una mutación en el sitio activo. Se preparó un mutante correspondiente de Der p 1. No se indican procedimientos de expresión de los mutantes en el Ejemplo 12. Yasuhara y col. (Clinical and Experimental Allergy, 2001, Volumen 31, páginas 116-124) describe un procedimiento para producir rDer f 1, en el que la expresión de la pro-forma de Der f 1 de tipo silvestre se obtiene en una etapa, en la que Pichia Pastoris se cultiva en medio BMMY a pH 6,0 durante 48-72 horas, después de lo cual se recogió el sobrenadante mediante centrifugación. La activación in vitro se logró autocatalíticamente mediante diálisis frente a tampón de acetato 10 mM (pH 4,0) a 4 ºC durante 48 horas. Jacquet y col. (Clin Exp Allergy 2002, 32_1048-1053) divulga la producción de Der p 1 que comprende el cultivo de P. pastoris que contiene plásmidos con ADNc que codifica proDer p 1 en medio de glucosa mínimo tamponado (BMG). La expresión se indujo mediante adición diaria de metanol al 0,5 %. El sobrenadante se recogió mediante centrifugación. El proDer p 1 recogido se purificó en una columna y mediante ultrafiltración. El proDer p 1 purificado se sometió a maduración mediante procesamiento autocatalítico de Der p 1 mediante diálisis frente a tampón de acetato de sodio 100 mM pH 4. De Halleux y col. (J Allergy Clin Immunol, 2006) divulga la producción de rproDer p 1 de tipo silvestre y un mutante no glicosilado de N52Q de rproder p 1. La expresión se llevó a cabo en Pichia pastoris X-33 usando pPICZaC como vector de expresión. El cultivo se cultivó a 30 ºC en un medio de fermentación especificado. Después el cultivo se indujo con metanol durante 3 días a 30. El pH del medio se ajustó a 6,0 durante el cultivo y la inducción. La mezcla de cultivo que se produjo como resultado de la fermentación se centrifugó y el sobrenadante se dializó frente a tampón de acetato de sodio 25 mM/l pH 4,5 y se mantuvo a 4,5 ºC durante aproximadamente 3 a 4 días para automaduración de pro-Der p 1 y pro-Der p 1 N52Q en los alérgenos maduros. Después se realizó la purificación mediante intercambio catiónico en SP-Sefarosa y etapas adicionales. El objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento mejorado para producir alérgeno de Grupo I de Ácaro maduro recombinante. Sumario de la invención Este objeto se consigue con la presente invención, que se refiere a un procedimiento para producir alérgeno de Grupo I de Ácaro recombinante maduro que comprende las etapas de a) proporcionar un sistema de expresión de alérgeno en la forma de una célula huésped seleccionada entre el grupo de levaduras que contienen un vector que comprende ADNc que codifica pro-alérgeno, b) cultivar el sistema de expresión de alérgeno en un pH de cultivo de entre 5,5 y 7,5 durante un periodo de cultivo para expresar pro-alérgeno para obtener una mezcla de cultivo que contiene pro-alérgeno, c) ajustar el pH de la mezcla de cultivo hasta un pH de maduración de entre 3,5 y 5,0, d) mantener la mezcla de cultivo al pH de maduración durante un periodo de maduración para convertir el pro-alérgeno en alérgeno maduro para obtener una mezcla de producto, y e) someter la mezcla de producto a un procedimiento de purificación para aislar el alérgeno maduro a partir de la mezcla de producto. La presente invención se basa en el hallazgo experimental de que es posible llevar a cabo la maduración de proalérgeno para obtener alérgeno maduro en la mezcla de cultivo en la que la expresión se ha llevado a cabo sin ninguna separación o purificación previa del producto a partir de la mezcla de cultivo. Un procedimiento de este tipo implica varias ventajas en comparación con los procedimientos de la técnica anterior. En primer lugar, el 2 E08805099 27-10-2011   procedimiento de la invención se simplifica en el sentido de que permite que la expresión y la maduración se lleven a cabo en el mismo reactor y por lo tanto se elimina la necesidad de una etapa de maduración separada. En segundo lugar, la maduración se puede llevar a cabo inmediatamente después de que la expresión se ha completado sin ninguna etapa de purificación intermedia, lo cual hace posible controlar el procedimiento de maduración más eficazmente, en particular para evitar que la maduración no controlada tenga lugar en las etapas de purificación. Una tercera ventaja del procedimiento de la invención es que permite una reducción del periodo de maduración, que es importante para minimizar la degradación tanto de pro-alérgeno como de alérgeno maduro y por lo tanto para aumentar el rendimiento. Una cuarta ventaja es que la expresión y secreción se permite que continúen durante el periodo de maduración, lo cual aumenta el rendimiento y/o permite una reducción del periodo de expresión. Una quinta ventaja es que las etapas de purificación se simplifican, ya que únicamente la forma madura del alérgeno se está aislando, mientras que en los procedimientos de la técnica anterior la etapa de expresión habitualmente dará como resultado un producto de fermentación que contiene una mezcla de proalérgeno y alérgeno maduro, lo cual hace que sean necesarias las etapas de purificación adicionales. Breve descripción de las figuras La Figura 1 muestra una SDS-PAGE de muestras de mezcla de cultivo tomadas durante el periodo de maduración a las 0, 3 y 18 horas. Descripción detallada de la invención Alérgeno de Grupo I de Ácaro El alérgeno de Grupo I de Ácaro producido por el procedimiento de la invención puede ser cualquier alérgeno de Grupo I de Ácaro conocido del orden Astigmata, en particular un alérgeno seleccionado entre el grupo que consiste en las superfamilias Acaroidea, Glycyphagoidea y Analgoidea, más particularmente seleccionado entre el grupo que consiste en las familias Acaridae, Glycyphagidae, Echimyopodidae y Pyroglyphidae, más particularmente seleccionados entre el grupo que consiste en los géneros Acarus, Blomia, Dermatophagoides, Euroglyphus, Glycyphagus, Lepidoglyphus y Tyrophagus. En una realización particular de la invención el alérgeno de Grupo I de Ácaro se selecciona entre el grupo que consiste en Aca s 1, Blo t1, Der f 1, Der p 1, Eur m 1, Gly d 1, Lep d 1 y Tyr p 1. Particularmente, el alérgeno de Grupo I de Ácaro se selecciona entre el grupo que consiste en Blo t1, Der f 1, Der p 1 y Eur m 1. Más particularmente el alérgeno de Grupo I de Ácaro es Der p 1. Adicionalmente, el alérgeno de Grupo I de Ácaro producido mediante el procedimiento de la invención puede ser una isoforma de origen natural de los alérgenos mencionados anteriormente, así como una variante mutada de los alérgenos mencionados anteriormente, por ejemplo, una variante mutada preparada mediante técnicas recombinantes. Las mutaciones se pueden realizar, por ejemplo, para obtener variantes hipoalergénicas de los alérgenos de tipo silvestre, para hacer a los alérgenos más estables y/o más fáciles de expresar y purificar y para cambiar el patrón de glicosilación del alérgeno, por ejemplo, sustituyendo un aminoácido que porta una cadena lateral de glicano. Sistema de expresión de alérgeno La célula huésped puede ser cualquier levadura adecuada para este fin, en particular levaduras del orden saccharomycetales, más particularmente levaduras seleccionadas entre el grupo que consiste en el género Pichia, Saccharomyces y Candida. En una realización particular de la invención, la célula huésped es de la familia saccharomycetaceae, más particularmente seleccionada entre el grupo que consiste en el género Pichia y Saccharomyces, y más particularmente entre el grupo que consiste en las especies Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae. El vector puede ser cualquier vector convencional usado como un portador del ADN que codifica el pro-alérgeno y que se puede introducir en la... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para producir alérgeno de Grupo I de Ácaro recombinante maduro que comprende las etapas de a) proporcionar un sistema de expresión de alérgeno en forma de una célula huésped seleccionada entre el grupo de levaduras que contienen un vector que comprende ADNc que codifica pro-alérgeno, b) cultivar el sistema de expresión de alérgeno a un pH de cultivo de entre 5,5 y 7,5 durante un periodo de cultivo para expresar pro-alérgeno para obtener una mezcla de cultivo que contiene pro-alérgeno, c) ajustar el pH de la mezcla de cultivo hasta un pH de maduración de entre 3,5 y 5,0, d) mantener la mezcla de cultivo al pH de maduración durante un periodo de maduración para convertir el pro-alérgeno en alérgeno maduro para obtener una mezcla de producto, y e) someter la mezcla de producto a un procedimiento de purificación para aislar alérgeno maduro a partir de la mezcla de producto. 2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la levadura se selecciona entre el grupo que consiste en los géneros Pichia, Saccharomyces y Candida. 3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la levadura es Pichia pastoris. 4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el vector se selecciona entre el grupo que consiste en plásmidos y fagos. 5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el vector es un plásmido. 6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el vector se selecciona entre el grupo que consiste en pGAPZaA, pPICZaA, pPICZaB, pPICZaC, pPIC9K y pHIL-S1. 7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el vector es pGAPZaA. 8. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el periodo de cultivo es de 12 horas a 144 horas, preferentemente de 24 horas a 120 horas, más preferentemente de 48 horas a 96 horas. 9. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el periodo de maduración es de 8 horas a 30 horas, preferentemente de 12 horas a 26 horas, más preferentemente de 14 horas a 24 horas, más preferentemente de 16 horas a 22 horas y más preferentemente de 17 horas a 21 horas. 10. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el pH de cultivo está entre 5,8 y 7,2, más preferentemente entre 6,0 y 7,0, más preferentemente entre 6,2 y 6,8. 11. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el pH de maduración está entre 3,7 y 4,8, más preferentemente entre 3,9 y 4,6 y más preferentemente entre 4,0 y 4,5. 12. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el alérgeno de Grupo I de Ácaro se selecciona entre el grupo que consiste en Aca s 1, Blo t1, Der f 1, Der p 1, Eur m 1, Gly d 1, Lep d 1 y Tyr p 1. 13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el alérgeno de Grupo I de Ácaro se selecciona entre el grupo que consiste en Blo t1, Der f 1, Der p 1 y Eur m 1. 14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el alérgeno de Grupo I de Ácaro es Der p1. 6 E08805099 27-10-2011   7 E08805099 27-10-2011

 

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