PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS QUE PRESENTAN ALTO CONTENIDO Y RENDIMIENTO EN ALMIDÓN Y ALTO BALANCE AMILOSA/AMILOPECTINA.

Procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido y rendimiento en almidón y alto balance amilosa/amilopectina. Campo de la invención La presente invención se engloba dentro del campo de la ingeniería genética y de la fisiología vegetal. Concretamente la invención comprende un procedimiento para la producción de plantas transgénicas con altos niveles de almidón y alto ratio amilosa/amilopectina, los vectores utilizados para transformar las células, las propias células transformadas, las plantas transgénicas obtenidas por dicho procedimiento y sus respectivos usos. Estado de la técnica anterior Tanto el almidón de las plantas como el glucógeno de bacterias y animales son homopolímeros ramificados de moléculas de glucosa unidas por enlaces covalentes de tipo -1,4 y -1,6. Estos polímeros constituyen formas importantes de almacenamiento de carbohidratos y energía. En las plantas el almidón se sintetiza en el plastidio, se acumula en grandes cantidades en órganos tales como semillas (trigo, cebada, maíz, guisante, etc.) y tubérculos (patata y batata entre otros) y es un constituyente fundamental de la dieta del ser humano. Por otro lado, el almidón es utilizado frecuentemente en la industria papelera, cosmética, farmacéutica y alimentaria, y también como materia prima fundamental para la fabricación de plásticos biodegradables, pinturas de bajo impacto medioambiental y bioetanol. Numerosas aplicaciones del almidón están basadas principalmente en el balance de amilosa y amilopectina, el cual determina la estructura del gránulo de almidón, así como su viscosidad en suspensiones acuosas. El ADPG es la molécula precursora universal de la biosíntesis del almidón y del glucógeno en plantas y bacterias, respectivamente. Está ampliamente asumido que la producción de este azúcar-nucleótido está exclusivamente controlada por el enzima ADPG pirofosforilasa (AGPasa) (EC 2.7.7.27) (1-4). Sin embargo, existen evidencias que muestran que la sacarosa sintasa (EC 2.4.1.13) (UDP-glucosa:D-fructosa-2-glucosil transferasa) está implicada en la síntesis de ADPG necesario para la biosíntesis del almidón (5-9). En lo que a mecanismos de degradación del ADPG se refiere, existen enzimas que hidrolizan ADPG tanto en plantas (10-13), como en bacterias (14, 15). En plantas, la degradación del almidón está controlada por reacciones hidrolíticas catalizadas por -amilasas, ß-amilasas y -glucosidasas (16, 17). Por el contrario, en animales, bacterias y levaduras son las alfa-l,4-glucan fosforilasas (GP) (EC 2.4.1.1) las que controlan la degradación de la molécula de glucógeno in vivo (18-22). Las GPs catalizan el corte reversible de uniones -1,4 de los extremos no reductores de poliglucanos tales como almidón, maltodextrinas y glucógeno, dando lugar a la producción de glucosa-1-fosfato (G1P). Las secuencias nucleotídicas de origen animal, vegetal o bacteriano, que codifican para enzimas con actividad GPs, son secuencias conservadas. Las plantas poseen GPs intra- y extra-plastidiales. A diferencia de lo que ocurre en bacterias, levaduras y animales, hasta el momento se desconoce la función de las GPs vegetales, especialmente las intraplastidiales. Teniendo en cuenta el carácter reversible de las GPs, es posible que su función en el metabolismo del almidón dependa del balance Pi/GlP (21). Siendo así, el alto balance Pi/GlP existente en la célula vegetal indicaría fuertemente que la GP plastidial no está implicada en la síntesis de almidón, reforzando la teoría de que la síntesis del almidón tiene lugar única y exclusivamente mediante procesos dependientes de la producción de ADPG. Existen evidencias que sugieren la posible implicación de GPs plastidiales en la degradación del almidón en hojas de Phaseoulus vulgaris y Arabidopsis thaliana (23). Por otro lado, se ha sugerido que las GPs plastidiales poseen funciones relacionadas con el estrés abiótico, la floración y el crecimiento de semillas (24-27). La discusión sobre la función biológica de las GPs plastidiales en plantas se complica aún más al tener en cuenta que mutantes STA4 del alga Chlamydomonas reinhardtii deficitarios en GP plastidial poseen niveles reducidos de almidón, lo cual sugiere que la GP plastidial no está implicada en la degradación del almidón en C. reinhardtii (28). Por otro lado, existen trabajos que muestran que las GPs plastidiales no están implicadas en la degradación del almidón en plantas vasculares tales como patata y trigo (29, 30). Añadiendo más confusión al debate sobre la posible implicación de las GP plastidiales en la degradación del almidón, algunos trabajos han mostrado una correlación positiva entre la actividad de la GP plastidial, la actividad de enzimas implicados en la síntesis del almidón y el acúmulo de almidón (25, 31-33). Existen trabajos en los que se describe la producción y caracterización de plantas con actividad GP reducida (24). Tales plantas acumulan niveles normales de almidón. Por otro lado, existe un trabajo en el que se describe que la sobre-expresión del gen glgP de E. coli que codifica para GP da lugar a bacterias con reducidos o nulos niveles de glucógeno (22). Finalmente, existen trabajos en los que se describe que la sobre-expresión de genes que codifican para GP de mamíferos da lugar a células de humanos con niveles reducidos de glucógeno (18). El estado de la técnica no ofrece una clara relación entre la enzima GP vegetal y su función concreta. Es más, hasta el momento no se conocen publicaciones referidas a la producción y/o caracterización de especies de plantas superiores con alta actividad GP. La presente invención se focaliza precisamente en este último aspecto al describir plantas transgénicas vasculares con alta actividad GP (tanto a nivel citosólico como plastidial) caracterizadas por expresar genes codificantes de proteínas/enzimas con actividad GP consiguiendo una elevada actividad GP (tanto a nivel citosólico como plastidial) y consecuentemente un elevado nivel y rendimiento en almidón así como un alto balance amilosa/amilopectina. Otro 2 ES 2 354 895 A1 aspecto importante a tener en cuenta es que la presente invención evidencia que la expresión de los genes que codifican para enzimas GP, y por lo tanto el aumento de actividad GP, tiene como resultado un incremento del contenido en almidón. Así, la presente invención rompe el prejuicio establecido en el estado de la técnica para la actividad de las GP de animales, bacterias y levaduras, donde se define que la actividad GP tiende al corte de las uniones -1,4 de los polímeros de glucosa dando lugar a G1P. También pone en evidencia que la GP bacteriana promueve la síntesis de almidón en plantas transgénicas que expresan el gen que codifica para dicha enzima. Así, el objeto de la invención es la producción de plantas con alto contenido y rendimiento de almidón y un alto balance amilosa/amilopectina como consecuencia del incremento de la actividad GP (tanto en el citosol como en el plastidio) al expresar genes que codifican para proteínas con actividad GP. Descripción de la invención Breve descripción de la invención Tal y como se ha comentado anteriormente, el objeto de la invención es la producción de plantas transgénicas con alto contenido y rendimiento de almidón y un alto balance amilosa/amilopectina como consecuencia del incremento de la actividad GP (tanto en el citosol como en el plastidio) al expresar genes que codifican para proteínas con alta actividad GP. A efectos de la presente invención, se hacen constar los siguientes términos: Célula: es la unidad mínima (morfológica y funcional) de todo ser vivo, capaz de actuar de manera autónoma. De particular interés a la presente invención resultan las células bacterianas y vegetales. Citoplasma: solución líquida que compone el medio intracelular. Plastidio: orgánulo propio de células vegetales. Es el encargado de realizar la fotosíntesis en los organismos eucariontes fotosintetizadores. Vector genético: vehículo utilizado para transferir material genético exógeno al interior de una célula. Cualquiera de los vectores conocidos en el estado de la técnica puede utilizarse en la presente invención. Sin embargo en la presente invención fue utilizado preferentemente Agrobacterium tumefaciens. Secuencias homologas: son secuencias nucleotídicas de ADN casi idénticas, entre las que se puede producir apareamiento de bases bajo estrictas condiciones. Expresión ectópica: se entiende por expresión ectópica de un gen cuando su producto se expresa en un lugar en el que normalmente no lo hace. Planta transgénica: planta cuyo genoma ha sido modificado mediante ingeniería genética con el objetivo de conseguir características biológicas diferentes a las de la planta silvestre (como es el caso de la presente invención). Alta actividad de... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la obtención de plantas transgénicas que comprende la transformación de la planta silvestre con el vector de expresión Agrobacterium tumefaciens CECT 7054 caracterizado por comprender el plásmido pBIN2035S-GP-NOS o Agrobacterium tumefaciens CECT 7055 caracterizado por comprender el plásmido pBIN20- B33-C1P-GP-NOS. 2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque la actividad GP de la proteína codificada y expresada en el interior de la planta transformada es al menos 5 veces superior a la actividad GP de la planta silvestre. 3. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque el contenido en almidón de las plantas transgénicas obtenidas es al menos un 20% superior al contenido en almidón de las plantas silvestres sin transformar cultivadas en las mismas condiciones. 4. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque el valor del contenido en amilosa de las plantas transgénicas obtenidas es al menos un 10% superior al valor del contenido en amilosa de las plantas silvestres sin transformar. 5. Procedimiento, según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la secuencia nucleotídica comprendida en el vector de expresión utilizado para transformar la planta silvestre se selecciona entre: a. Una secuencia nucleotídica que codifique para la secuencia aminoacídica caracterizada por la SEQ ID NO: 4; b. Una secuencia nucleotídica caracterizada por la SEQ ID NO: 3; c. Una secuencia nucleotídica que hibride con las definidas en a o b y que codifique para un producto enzimático con actividad GP; d. Una secuencia nucleotídica que difiera de las definidas en a, b o c debido a la degeneración del código genético. 6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la elevada actividad GP dentro de la planta transgénica transformada puede conseguirse tanto a nivel citosólico como a nivel plastidial. 7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la elevada actividad GP a nivel citosólico es conseguida mediante la transformación de la planta silvestre con Agrobacterium tumefaciens CECT 7054 que comprende el plásmido pBIN2035S-GP-NOS. 8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la elevada actividad GP a nivel plastidial es conseguida mediante la transformación de la planta silvestre con Agrobacterium tumefaciens CECT 7055 que comprende el plásmido pBIN20-B33-C1P-GP-NOS. 9. Vector de expresión Agrobacterium tumefaciens CECT 7054 caracterizado por comprender el plásmido pBIN2035S-GP-NOS. 10. Vector de expresión Agrobacterium tumefaciens CECT 7055 caracterizado por comprender el plásmido pBIN20-B33-C1P-GP-NOS. 11. Célula transformada o infectada con el vector de las reivindicaciones 9 o 10. 12. Célula, según la reivindicación 11, caracterizada por ser una célula bacteriana o vegetal. 13. Célula bacteriana de E. coli CECT 7071, según la reivindicación 12, caracterizada por estar transformada con el plásmido pET15b-glgP y expresar el gen que codifica para la proteína GP recombinante. 14. Célula vegetal, según la reivindicación 12, caracterizada por estar transformada o infectada por Agrobacterium tumefaciens CECT 7054 que comprende el plásmido pBIN2035S-GP-NOS o por Agrobacterium tumefaciens CECT 7055 que comprende el plásmido pBIN20-B33-C1P-GP-NOS. 15. Célula vegetal, según la reivindicación 14, caracterizada por pertenecer a cualquiera de las siguientes especies de plantas: patata (Solanum tuberosum), tabaco (Nicotiana tabacum), arroz (Oryza sativa), maíz (Zea mays) o arabidopsis (Arabidopsis thaliana). 16. Uso de la célula de la reivindicación 13 para la producción de la proteína GP recombinante activa. 13 ES 2 354 895 A1 17. Uso de la célula de la reivindicación 13 para la producción de anticuerpos específicos frente a GP. 18. Uso de la célula de cualquiera de las reivindicaciones 11,12,14 y/ó 15 para la producción de almidón. 19. Planta transgénica transformada con el vector de las reivindicaciones 9 o 10 caracterizada por poseer alta actividad GP respecto a la planta silvestre, tanto a nivel citosólico como plastidial y, consecuentemente, un elevado contenido y rendimiento en almidón y un alto balance amilosa/amilopectina. 20. Planta transgénica, según la reivindicación 19, caracterizada porque su actividad GP es al menos 5 veces superior a la actividad GP de la planta silvestre sin transformar. 21. Planta transgénica, según la reivindicación 19, caracterizada porque su contenido en almidón es al menos un 20% superior al contenido en almidón de las plantas silvestres sin transformar. 22. Planta transgénica, según la reivindicación 19, caracterizada porque el valor de su contenido en amilosa es al menos un 10% superior al valor del contenido en amilosa de las plantas silvestres sin transformar. 23. Planta transgénica, según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, caracterizada por expresar el gen glgP (SEQ ID NO: 3) y codificar para proteínas con alta actividad GP. 24. Planta transgénica, según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, seleccionada el grupo que comprende: patata (Solanum tuberosum), tabaco (Nicotiana tabacum), arroz (Oryza sativa), maíz (Zea mays) o arabidopsis (Arabidopsis thaliana). 25. Uso de las plantas transgénicas de las reivindicaciones 19 a 24, para la producción de almidón. 14 ES 2 354 895 A1 ES 2 354 895 A1 16 ES 2 354 895 A1 17 ES 2 354 895 A1 18 ES 2 354 895 A1 19 ES 2 354 895 A1 ES 2 354 895 A1 21 ES 2 354 895 A1 22 ES 2 354 895 A1 23 ES 2 354 895 A1 24 ES 2 354 895 A1 ES 2 354 895 A1 LISTA DE SECUENCIAS <110> IDEN CARBOHYDRATE BIOTECHNOLOGY, S.L. <120> Procedimiento de producción de plantas transgénicas que presentan un alto contenido y rendimiento en almidón y con alto balance amilosa/amilopectina. <130> P-02382 <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 43 <212> DNA <213> Escherichia coli <223> Cebador 5 de glgP <400> 1 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Escherichia coli <223> Cebador 3 de glgP <400> 2 <210> 3 <211> 2448 <212> DNA <213> Escherichia coli <223> Gen glgP <400> 3 1 ES 2 354 895 A1 2 <210> 4 <211> 815 <212> PRT <213> Escherichia coli <223> Péptido glgP <400> 4 ES 2 354 895 A1 3 ES 2 354 895 A1 4 ES 2 354 895 A1 ES 2 354 895 A1 6 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA