Procedimiento de producción de alcohol a partir de biomasa lignocelulósica pretratada en el que la etapa de hidrólisis enzimática se realiza con unas enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas producidas utilizando al menos un efluente procedente de otro procedimiento de producción de etanol que utiliza como materia prima una planta productora de azúcar,

dicho efluente comprendiendo unos jugos azucarados procedentes de los lavados de remolachas o de cañas de azúcar, y/o de las melazas de la industria azucarera, la producción de enzimas realizándose con cepas de microorganismos celulolíticos que pertenecen a los géneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium o Schizophyllum, utilizando la sacarosa como fuente de carbono para su crecimiento, de forma natural o tras su modificación

Campo técnico

La presente invención se inscribe en el campo de la producción de biocarburantes. Esta se refiere más en particular a la producción de enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas en el campo de la producción de alcohol a partir de materiales celulósicos o lignocelulósicos (biocarburante de segunda generación). La lógica económica y logística actual quiere que los lugares de producción de biocarburantes de segunda generación sean los mismos que los de producción de primera generación, constituyendo el conjunto una “biorefinería” en la que la totalidad del vegetal se valoriza. De este modo, a partir de una planta productora de azúcar, se pretende valorizar la caña de azúcar y los residuos lignocelulósicos de la caña.

Antecedentes de la invención

Desde los años 1970, la transformación de la biomasa lignocelulósica en etanol, tras la hidrólisis de los polisacáridos que la componen en azúcares fermentables, ha sido objeto de numerosos estudios.

Los residuos lignocelulósicos están formados en su mayor parte por alrededor de un 40 a un 50 % de celulosa, de un 20 a un 25 % de hemicelulosa y de un 15 a un 25 % de lignina.

De estos tres polímeros, celulosa, hemicelulosa y lignina, la celulosa es la principal fuente de azúcares fermentables en etanol ya que está formada por glucosa, esta última fermentándose con facilidad en etanol mediante Saccharomyces cerevisiae en unos procedimientos industriales probados y productivos. Las pentosas que contienen las hemicelulosas no se convierten de manera eficaz en etanol. Otros microorganismos, entre los géneros Saccharomyces, Pichia, Candida, Pachysolen, Zymomonas, Klebsiella, Escherichia, se pueden seleccionar para valorizar los azúcares monómeros procedentes de la biomasa en etanol.

El procedimiento de transformación de los materiales lignocelulósicos en alcohol comprende una etapa de pretratamiento físico-químico, seguida de una etapa de hidrólisis enzimática o química, de una etapa de fermentación alcohólica de los azúcares liberados y de una etapa de recuperación del alcohol.

La etapa de pretratamiento tiene como objetivo liberar los azúcares contenidos en las hemicelulosas en forma de monómeros, esencialmente pentosas, como la xilosa y la arabinosa, y hexosas, como la galactosa, la manosa y la glucosa, y mejorar la accesibilidad de la celulosa embebida dentro de la matriz de lignina y hemicelulosa. Existen numerosas tecnologías: cocciones ácidas, cocciones alcalinas, explosión de vapor, procedimientos organosolv, etc. La eficacia del pretratamiento se mide por la tasa de recuperación de las hemicelulosas y por la susceptibilidad a la hidrólisis del residuo celulósico. Los pretratamientos ácidos en condiciones suaves y por explosión de vapor son los que mejor se adaptan. Estos permiten una recuperación total de las pentosas y una buena accesibilidad de la celulosa en la hidrólisis.

El residuo celulósico se hidroliza, ya sea por vía ácida, o por vía enzimática con la utilización de enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas. Microorganismos como los hongos que pertenecen a los géneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium o Schizophyllum, o las bacterias anaerobias que pertenecen, por ejemplo, al género Clostridium, producen estas enzimas, que contienen en particular las celulasas y las xilanasas, adaptadas a la hidrólisis completa de los polímeros que forman los vegetales.

El procedimiento ácido, que se realiza mediante un ácido fuerte, ácido sulfúrico en particular, es eficaz, pero requiere grandes cantidades de productos químicos (ácido y a continuación base para la neutralización). La hidrólisis enzimática no presenta este inconveniente; esta se realiza, por otra parte, en unas condiciones suaves y es eficaz. Por el contrario, el coste de las enzimas sigue siendo muy elevado. Por esta razón, se han hecho muchos estudios para reducir este coste: el aumento de la producción de enzimas, en primer lugar, seleccionando las cepas hiperproductoras y mejorado los procedimientos de fermentación, la reducción de la cantidad de enzimas en hidrólisis a continuación, optimizando la fase de pretratamiento o mejorando la actividad específica de estas enzimas. Durante la última década, los principales estudios se han dedicado a analizar los mecanismos de acción de las celulasas y de expresión de las enzimas con el fin de conseguir excretar el complejo enzimático más apropiado para la hidrólisis de los substratos lignocelulósicos modificando las cepas con las herramientas de biología molecular.

El microorganismo más utilizado para la producción de celulasas es el hongo Trichoderma reesei. Las cepas salvajes tienen la capacidad de excretar, en presencia de un sustrato inductor, la celulosa, por ejemplo, el complejo enzimático considerado como el mejor adaptado para la hidrólisis de la celulosa. Las enzimas del complejo enzimático contienen tres grandes tipos de actividades; las endoglucanasas, las exoglucanasas y las celobiasas. Otras proteínas que poseen propiedades indispensables para la hidrólisis de los materiales lignocelulósicos también se producen mediante Trichoderma reesei, las xilanasas, por ejemplo. La presencia de un sustrato inductor es indispensable para la expresión de las enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas. La clase de sustrato carbonado influye de forma determinante en la composición del complejo enzimático. Es el caso de la xilosa, que, asociada a un sustrato carbonado inductor, como la celulosa o la lactosa, permite mejorar de forma significativa la actividad denominada xilanasa.

Las técnicas de genética clásica mediante mutación han permitido la selección de cepas de Trichoderma reesei hiperproductoras de celulasas, como las cepas MCG77 (Gallo – patente US 4275 167), MCG 80 (Allen, A. L. y Andreotti, R. E., Biotechnol-Bioengi 1982; 12, 451-459, 1982), RUT C30 (Montenecourt, B. S. y Eveleigh, D. E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782) y CL847 (Durand y otros, 1984, Proc. Colloque SFM “Genética de los microorganismos industriales”, París, H. HESLOT Ed., pág. 39-50). Las mejoras han permitido obtener unas cepas hiperproductoras menos sensibles a la represión catabólica sobre azúcares monómeros en particular, glucosa por ejemplo, con respecto a las cepas salvajes.

Se han obtenido cepas recombinantes a partir de las cepas de Trichoderma reesei Qm9414, RutC30, CL847 clonando genes heterólogos, por ejemplo la invertasa de Aspergillus niger que permite a la Trichoderma reesei utilizar la sacarosa como fuente de carbono. Estas cepas han conservado su hiperproductividad y su aptitud para cultivarse en fermentador.

El procedimiento de producción de celulasas mediante Trichoderma reesei ha sido objeto de mejoras importantes con el objetivo de extrapolarlo a la escala industrial.

Para obtener buenas producciones de enzimas, es necesario aportar una fuente de carbono rápidamente asimilable para el crecimiento de Trichoderma reesei y un sustrato inductor que permita la expresión de las celulasas y la secreción en el medio de cultivo. La celulosa puede desempeñar estas dos funciones; no obstante, es difícil de utilizar en la etapa industrial y se ha sustituido por fuentes de carbono solubles como la glucosa, la xilosa o la lactosa, la lactosa desempeñando también la función de sustrato inductor. Se han descrito otros azúcares solubles, como la celobiosa y la soforosa, como inductores, pero son demasiado caros para utilizarse en la etapa industrial. No obstante, se ha constatado que las producciones de celulasas mediante Trichoderma reesei, con sustratos solubles, son muy inferiores a las que se obtienen sobre celulosa en “batch”. Esto se debe al efecto represor de los azúcares fácilmente asimilables, en alta concentración. La alimentación de forma continua de los sustratos carbonados solubles ha permitido alzar la represión catabólica limitando la concentración residual en los cultivos y optimizando la cantidad de azúcar que permite obtener un mejor rendimiento y una mejor productividad enzimática (véase la patente FR-B-2 555 603 presentada a nombre de la solicitante).

La lactosa continúa siendo, en un procedimiento de producción industrial de enzimas celulolíticas, uno de los sustratos más adecuados y uno de los menos caros; no obstante, continúa siendo gravoso y representa alrededor de un tercio del precio de coste de las enzimas. A pesar de todos los progresos que se han realizado, el coste de las enzimas continúa teniendo un puesto importante (de entre un 30 y un 50 %) en la transformación... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de producción de alcohol a partir de biomasa lignocelulósica pretratada en el que la etapa de hidrólisis enzimática se realiza con unas enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas producidas utilizando al menos un efluente procedente de otro procedimiento de producción de etanol que utiliza como materia prima una planta productora de azúcar, dicho efluente comprendiendo unos jugos azucarados procedentes de los lavados de remolachas o de cañas de azúcar, y/o de las melazas de la industria azucarera, la producción de enzimas realizándose con cepas de microorganismos celulolíticos que pertenecen a los géneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium o Schizophyllum, utilizando la sacarosa como fuente de carbono para su crecimiento, de forma natural o tras su modificación.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la producción de enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas se realiza con unos hongos que utilizan, además, como fuente de carbono inductora otro azúcar soluble industrial o un extracto de la fracción hemicelulósica en forma de monómeros que proceden de la biomasa pretratada o un extracto de vinazas de fermentación de productos de hidrólisis de biomasa lignocelulósica o una mezcla de estos.

3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2 en el que el microorganismo pertenece a la especie Trichoderma reesei.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores en el que la biomasa lignocelulósica se selecciona entre la paja, la madera, los cultivos forestales, los residuos de plantas productoras de alcohol, productoras de azúcar o productoras de cereal, los residuos de la industria papelera y los productos de transformación de los materiales celulósicos y lignocelulósicos.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores en el que a la etapa de hidrólisis enzimática le sigue una etapa de fermentación, y a continuación una etapa de destilación y de separación del alcohol.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 en el que la etapa de fermentación es de tipo fermentación etanólica y el alcohol que se obtiene es etanol.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 en el que la etapa de fermentación es de tipo fermentación ABE y el alcohol que se obtiene es una mezcla de butanol y de etanol.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 en el que la etapa de fermentación es de tipo fermentación IBE y el alcohol que se obtiene es una mezcla de butanol, de etanol y de isopropanol.

9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8 en el que la hidrólisis enzimática y la fermentación se realizan de forma simultánea y les sigue una etapa de destilación y de separación del alcohol.

**(Ver fórmula)**

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