PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN DE PARTÍCULAS DE POLÍMERO REVESTIDAS QUE CONTIENEN CRISTALES SUPERPARAMAGNÉTICOS.

Un procedimiento para la preparación de partículas de polímero revestidas que contienen cristales superparamagnéticos,

procedimiento que comprende hacer reaccionar partículas de polímero con la superficie funcionalizada, de un diámetro inferior a 0,5 m, que contienen cristales superparamagnéticos, con al menos un poliisocianato y al menos un diol, diol que se selecciona entre el grupo que consiste en polietilenglicoles y dioles de fórmula HO((CH2)mO)nH (siendo n un número entero de 1 a 15 y m un número entero de 2 a 6)

La invención se refiere a un procedimiento para la preparación de partículas de polímero magnéticas revestidas.

Las partículas de polímero magnéticas son de utilidad general en diversos campos médicos y biológicos, por ejemplo, como vehículos de transporte para el suministro de productos farmacéuticos, para fines diagnósticos, para 5 fines de separación y de síntesis. Tales partículas se basan en sus propiedades magnéticas para realizar estas funciones. En aplicaciones de ensayos diagnósticos, por ejemplo, la aplicación de un campo magnético a una muestra que contiene un analito unido a partículas de polímero magnéticas, permite el aislamiento del analito sin usar la centrifugación o la filtración y, en aplicaciones terapéuticas, la aplicación de un campo magnético al paciente puede servir para seleccionar la diana para las partículas de polímero magnéticas con el fin de dirigirlas al sitio corporal 10 deseado.

Por magnético se entiende aquí que las partículas de polímero contienen cristales superparamagnéticos. Así, las partículas de polímero magnéticas son magnéticamente desplazables pero no son permanentemente magnetizables. Se conocen muchos procedimientos para preparar partículas de polímero magnéticas, de los que un gran número implica preparar partículas de polímero que contienen maghemita o magnetita a partir de óxidos de hierro magnéticos 15 preformados, por ejemplo, magnetita. En el documento US-A-4.654.267 (Ugelstad), cuyo contenido se incorpora aquí por referencia, se describen algunos de los procedimientos implicados.

Con el desarrollo de dispositivos que pueden medir cargas muy pequeñas de magnetismo así como el crecimiento de la nanotecnología se ha previsto que los usuarios de partículas magnéticas desearán partículas más pequeñas con las que realizar en el futuro ensayos, etc. Además, las partículas magnéticas necesitarán ser 20 manipuladas para tener grupos reactivos que puedan acoplarse fácilmente con marcadores para que resulte una fase sólida ideal para procedimientos bioquímicos.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que se pueden producir partículas magnéticas con características superficiales particularmente útiles haciendo reaccionar partículas de polímero magnéticas funcionalizadas en la superficie con una combinación de monómeros poliisocianato/diol para producir una partícula de 25 polímero magnética “revestida”. Tales partículas se acoplan fácilmente además con marcadores resultando un soporte de fase sólida útil en una variedad de campos.

Visto un primer aspecto de la invención, la invención proporciona por tanto un procedimiento para la preparación de partículas de polímero revestidas que contienen cristales superparamagnéticos, procedimiento que comprende hacer reaccionar partículas de polímero de un diámetro inferior a 0,5 m que contienen cristales 30 superparamagnéticos, funcionalizadas en la superficie, con al menos un poliisocianato, por ejemplo diisocianato, y al menos un diol, preferiblemente al menos dos dioles.

Los dioles son polietilenglicoles o son de la fórmula HO((CH2)mO)nH (siendo n un número entero de 1 a 15, por ejemplo, de 2 a 10, preferiblemente de 2 a 4, y m un número entero de 2 a 6, preferiblemente de 2 a 3, muy preferiblemente 2). Cuando sólo se emplea un diol, preferiblemente éste es un polietilenglicol, por ejemplo 35 polietilenglicol 300, 400, 500 o 600.

Las partículas de polímero usadas en el procedimiento de la invención pueden ser cualesquiera partículas de polímero de un tamaño adecuado, opcionalmente porosas, que tienen una superficie funcionalizada, por ejemplo, partículas de Ugelstad descritas en general en el documento US-A-4.654.267. También son asequibles partículas adecuadas de Ademtech, por ejemplo, partículas Carboxyl-Ademtech 0212 que comprenden un revestimiento superficial 40 de ácido carboxílico.

La funcionalidad de la superficie de la partícula de polímero preferiblemente es un grupo capaz, opcionalmente con activación, de reaccionar con un poliisocianato para unir covalentemente el poliisocianato a la superficie. Muy preferiblemente, la superficie tiene la funcionalidad amina o carboxilo.

Preferiblemente, la partícula de polímero se hace de combinaciones de polímeros vinílicos, por ejemplo 45 estirenos, acrilatos y/o metacrilatos. Opcionalmente el material polímero se puede reticular, por ejemplo, por incorporación de agentes reticuladores, por ejemplo, como comonómeros, por ejemplo, divinilbenceno (DVB) o dimetacrilato de etilenglicol. Se prefieren partículas que comprenden DVB.

Los expertos en la técnica conocerán las cantidades apropiadas de agentes reticuladores (por ejemplo comonómeros) requeridas. Preferiblemente, el polímero es un polímero estirénico reticulado (por ejemplo un polímero 50 de estireno-divinilbenceno que puede estar funcionalizado en la superficie usando un comonómero que contiene un grupo nitro, por ejemplo nitro-estireno y posterior reducción), o un polímero (met)acrílico reticulado con superficie funcionalizada usando un comonómero que contiene un grupo epoxi (por ejemplo metacrilato de glicidilo) y posterior aminación (por ejemplo, por reacción con etilendiamina).

Los cristales superparamagnéticos de las partículas de polímero usados en el procedimiento de la invención 55 pueden ser de cualquier material capaz de ser de ser depositado en forma cristalina superparamagnética sobre las

partículas de polímero o en sus poros si la partícula es porosa. Se prefieren óxidos de hierro magnéticos, por ejemplo, magnetita o maghemita; sin embargo, si se desea, los cristales pueden ser de óxidos metálicos mezclados u otro material magnético. La cantidad total presente de material magnético cristalino generalmente es de más de 20%, preferiblemente de más de 25%, deseablemente de más de o igual a 30% (en peso, por ejemplo, hasta de 85% en peso o de como mínimo 50% en peso, por ejemplo de 30 a 80% en peso). El porcentaje se calcula sobre la base de Fe (o 5 metal equivalente en el caso de materiales magnéticos que no son óxidos de hierro) en relación al peso total en seco de las partículas de polímero.

Se requieren concentraciones más altas de cristales magnéticos en las partículas de polímero para las partículas pequeñas reivindicadas aquí, para que puedan ser atraídas con éxito por un imán durante cualquier proceso de aislamiento. Otra manera de aumentar la facilidad con la que las perlas son arrastradas hacia un imán es hacer que 10 una parte de las mismas sean remanentes.

El grado de remanencia puede medirse con un magnetómetro de muestra vibrante realizando curvas de histéresis, Las curvas se producen midiendo la magnetización de las partículas en diferentes potencias de campo, desde, por ejemplo, -1,5 teslas a +1,5 teslas y retroceso. Si la magnetización máxima se designa Ms y el valor de cruce del eje Y (potencia de campo cero) se designa Mr, la relación Mr/Ms indicará lo remanentes que son las partículas. 15

Las partículas con una relación Mr/Ms inferior a 0,15 se pueden considerar superparamagnéticas para la mayoría de aplicaciones. El intervalo de tiempo para ir de –1,5 a +1,5 teslas debe ser de 10 min. Las partículas con valores de remanencia bajos a menudo tienen un arrastre acrecentado hacia un imán a causa de la agregación, pero las fuerzas entre ellas con tan pequeñas que esto no influye sobre el lavado de la muestra.

Las partículas porosas de polímero pueden tener partículas magnéticas depositadas en sus poros por técnicas 20 estándar. Como otra posibilidad, se pueden preparar partículas de polímero porosas a partir de nitroestireno y DVB e introducción de material magnético. Se prefiere el uso de aminoestireno, en especial 4-aminoestireno, como monómero o comonómero en la preparación de material polímero que presenta grupos amino. El uso de este monómero o comonómero obvia la necesidad de posteriores reacciones de nitración después de polimerización y reducción. Además, la naturaleza más predecible (homogeneidad) del revestimiento obtenido por este procedimiento permite que 25 se aplique un revestimiento más fiable.

Las partículas de polímero se pueden formar por funcionalización de la superficie o, alternativamente, la funcionalización del material polímero se puede realizar después de la polimerización mediante, por ejemplo, nitración y posterior reducción de los grupos así formados en...

1. Un procedimiento para la preparación de partículas de polímero revestidas que contienen cristales superparamagnéticos, procedimiento que comprende hacer reaccionar partículas de polímero con la superficie funcionalizada, de un diámetro inferior a 0,5 m, que contienen cristales superparamagnéticos, con al menos un poliisocianato y al menos un diol, diol que se selecciona entre el grupo que consiste en polietilenglicoles y dioles de 5 fórmula HO((CH2)mO)nH (siendo n un número entero de 1 a 15 y m un número entero de 2 a 6).

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que se emplean al menos dos dioles.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que m es 2.

4. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que los mencionados dioles son dietilenglicol y tetraetilenglicol. 10

5. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que uno de los mencionados dioles es polietilenglicol.

6. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el mencionado poliisocianato es 4,4-metilenbis(fenilisocianato) o un poliisocianato que comprende 4,4-metilenbis-(fenilisocianato) con restos de CH2-fenilisocianato.

7. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el mencionado poliisocianato es un 15 diisocianato.

8. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que las mencionadas partículas se hacen reaccionar, en una primera etapa, con una mezcla de poliisocianato y al menos un diol, en el que el poliisocianato está en un exceso molar en relación al (los) diol(es) y, en una segunda etapa, se hace reaccionar seguidamente con al menos un diol.

9. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que se usan dos dioles en la primera etapa de la reacción y 20 uno o dos dioles en la segunda etapa.

10. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que se usan dietilenglicol y tetraetilenglicol en ambas etapas de la reacción.

11. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las partículas se hacen reaccionar, en una primera etapa, con poliisocianato en ausencia de diol y, en una segunda etapa, se hacen reaccionar con al 25 menos un diol.

12. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que se emplea un diol y el mencionado diol es un polietilenglicol.

13. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que las partículas tienen funcionalidad amina. 30

14. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que las mencionadas partículas de polímero funcionalizadas en la superficie son partículas de polímero de estireno-divinilbenceno nitradas y reducidas.

15. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que el diámetro de las partículas de polímero está entre 150 y 250 nm.

16. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que la mencionada partícula revestida se 35 tosila posteriormente.

17. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que, tras la reacción de revestimiento, las mencionadas partículas se acoplan a una molécula de fármaco, un resto informador o un ligando.

18. Un procedimiento según la reivindicación 17, en el que el mencionado ligando es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un fragmento de anticuerpo, un ácido nucleico, un oligonucleótido, una proteína, un oligopéptido, 40 un polisacárido, un azúcar, un péptido, una molécula de ácido nucleico que codifica para un péptido, un antígeno o un fármaco.

19. Un procedimiento según la reivindicación 18, en el que el mencionado ligando es estreptavidina.

20. Una partícula obtenible por el procedimiento de cualquier reivindicación precedente.

21. Uso de una partícula según la reivindicación 20 en un ensayo. 45

22. Uso según la reivindicación 21, en el que el mencionado ensayo es para la detección de ácido nucleico o es un inmunoensayo.

23. Uso de una partícula según la reivindicación 21 en cromatografía de interacción hidrófoba o cromatografía de fase inversa.