PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE UN COMPONENTE ACTIVO DE UN FÁRMACO O AGENTE DE DIAGNÓSTICO EN CULTIVO EN SUSPENSIÓN DE CÉLULAS MDCK.

Procedimiento para la preparación de un componente activo de un fármaco o agente de diagnóstico en cultivo en suspensión de células MDCK La invención se refiere a procedimientos para la preparación de un componente activo de una vacuna, en los que se multiplican virus en células MDCK a escala industrial en cultivo en suspensión. Las enfermedades infecciosas, especialmente las infecciones virales, tienen al igual que antes una gran importancia médica. Por tanto, sigue existiendo la necesidad invariable de poner a disposición mejores procedimientos mediante los cuales puedan multiplicarse virus en cultivo para hacer posible la investigación de virus y la preparación de vacunas. Especialmente la producción de vacunas contra infección viral requiere normalmente la multiplicación y el aislamiento de grandes cantidades del virus en cuestión. En función del virus respectivo, en el estado de la técnica se usan diferentes sistemas huésped y condiciones de cultivo para la multiplicación de virus. Como sistemas huésped se usan animales huésped estándar, huevos de gallina embrionarios, cultivos primarios de células de tejido o líneas celulares establecidas permanentes (Rolle y Mayr [editores], Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre, 1978; Mahy [editor], Virology, A Practical Approach, 1985; Horzinek [editor] Kompendium der allgemeine Virologie, 1985). La multiplicación de virus en huevos de gallina embrionarios está ligada a un alto consumo de tiempo y de costes. Los huevos deben incubarse antes de la infección y a continuación probarse para la viabilidad de los embriones. Sólo los embriones vivos pueden multiplicar virus. Después de realizarse la infección con el virus que va a multiplicarse y la posterior incubación, los embriones se matan finalmente. Los virus que pueden aislarse de los huevos se liberan de contaminantes y se concentran. Como la multiplicación de virus en huevos incubados no es posible bajo condiciones estrictamente estériles, los microorganismos patógenos contaminantes deben eliminarse de las cepas aisladas, siempre y cuando éstos deban estar disponibles para una aplicación médica o diagnóstica. Las células huésped eucariotas de líneas celulares definidas ofrecen una alternativa a la multiplicación de virus en huevos de gallina (Gregersen, J.P., Pharmazeutische Biotechnologie, Kayser y Müller [editores], 2000, páginas 257-281). Sin embargo, debido a las persistentes contaminaciones por virus extraños o debido a la falta de pruebas de la ausencia de virus de origen e historia poco claros, numerosas líneas celulares no son adecuadas para la preparación de vacunas o preparados similares que puedan usarse médicamente. Por el contrario, en el caso de las células Vero derivadas de células renales de monos se trata de un sistema huésped que ya se usa en la multiplicación de virus individuales (virus de la poliomielitis, virus de la rabia) para la preparación de vacunas. Estas células pueden obtenerse en diversos bancos de células (como, por ejemplo, de la Colección americana de cultivos tipo, ATCC) y además también están a disposición por la Organización Mundial de la Salud (OMS) de un banco de células probado para investigación médica. En el caso de estas células Vero se trata de líneas adherentes que para su crecimiento necesitan superficies de soporte como, por ejemplo, frascos de cristal, placas de cultivo de plástico o frascos de plástico. En un cultivo de células correspondientes, en el fermentador se realiza el crecimiento en los llamados microsoportes, es decir, esférulas de plástico generalmente pequeñas sobre cuya superficie pueden crecer las células. Se sabe que, además de las células Vero anteriormente mencionadas, también pueden multiplicarse activamente, por ejemplo, células BHK adherentes (Baby Hamster Kidney de riñón de hámster bebé) y MDCK adherentes (Madin Darby Canine Kidney de riñón canino de Madin Darby) y otras células de varios tipos de virus y usarse para el uso como sustrato para la preparación de productos farmacéuticos o considerarse su uso. En la ATCC CRL34 (NBL-2) de la línea celular MDCK también se multiplicaron experimentalmente, además de virus de la gripe, el virus de la estomatitis vesicular, el virus Coxsackie B5 (pero no B3 ni B4), el tipo de reovirus 2 y 3, el tipo de adenovirus 4 y 5, así como el virus de la variolovacuna. Sin embargo, todas las publicaciones correspondientes se fijan exclusivamente en cultivos adherentes (véase la información de producto de ATCC). Sin embargo, para la multiplicación de mayores cantidades de células se prefiere el cultivo en suspensión, pudiendo multiplicarse hasta la fecha sólo las células linfoides y algunas transformadas en este sistema (Lindl [editor], Zell- und Gewebekultur, 2000, páginas 173 y siguientes). Una línea celular MDCK que puede crecer en medios de cultivo en suspensión libres de proteínas se da a conocer en el documento WO 97/37000. También se describe la multiplicación de virus de la gripe usando las células huésped correspondientes. Además de la selección de un sistema de células o huésped adecuado, también son de gran importancia las condiciones de cultivo bajo las cuales se multiplica una cepa de virus para alcanzar un rendimiento alto aceptable. Por tanto, para maximizar el rendimiento de la cepa de virus deseada deben adaptarse específicamente tanto el sistema huésped como las condiciones de cultivo para alcanzar condiciones medioambientales favorables para la cepa de virus deseada. Por tanto, para conseguir un alto rendimiento de las distintas cepas de virus se necesita un sistema que logre condiciones de crecimiento óptimas. Muchos virus están limitados a sistemas huésped especiales de los que algunos son muy ineficaces en cuanto al rendimiento de virus. Además, los sistemas de producción eficientes se basan frecuentemente en adaptaciones de la población de virus al sistema de cultivo respectivo usando frecuentemente etapas intermedias usando otros sistemas huésped y usando aditivos de proteínas la mayoría de las veces suero de origen animal o humano. 2 Además, los expertos saben que casi todos los cultivos celulares después de la multiplicación inicial con adición de suero u otros factores de crecimiento pueden mantenerse al menos durante un cierto tiempo sin adiciones de suero o de proteínas. Así, por ejemplo, un cultivo celular discrecional puede transferirse en el momento de la infección con el virus o poco antes de la cosecha a un medio sin suero o aditivos de proteínas y mantenerse hasta la cosecha. Esto es desde hace años práctica habitual para obtener material de virus para vacunas o pruebas diagnósticas evitando o reduciendo las proteínas extrañas. Las vacunas de cultivos celulares que se mantuvieron sin esta práctica durante la fase de infección con adición de suero tendrán grandes problemas para que la aplicación sea aprobada en seres humanos o animales ya que los constituyentes del suero apenas pueden eliminarse suficientemente (véanse las recomendaciones de la OMS Proposed requirements for Measles Vaccine (Live), Requirements for Biological Subtances, nº 12, revisión de 1978). También se sabe que algunos virus pueden multiplicarse sólo muy escasamente o incluso no pueden multiplicarse en medios que contienen proteínas. A este respecto se trata de aquellos virus que para su multiplicación en sistemas de cultivo dependen de la actividad de enzimas proteolíticas (proteasas). Como estas proteasas se inhiben competitivamente mediante las adiciones de proteínas al medio, lógicamente aquí queda descartada la adición de proteínas al menos desde el momento de la infección o la fase de producción. Ejemplos de virus que normalmente deben multiplicarse con la adición de proteasas y, por tanto, para conseguir buenos rendimientos a ser posible sin aditivos de proteínas al medio de infección son virus de la gripe y rotavirus. Otros tipos de virus como, por ejemplo, paramixovirus y reovirus también pueden beneficiarse durante la multiplicación de medios a ser posible pobres en proteínas (Ward y col. (1984) J.Clin.Microbiol. 748-753 Efficiency of Human Rotavirus Propagation in Cell Culture). El documento WO 96/15231 propone cultivar células Vero y otras células en cultivo celular debiendo usarse un medio que se las arregla sin los aditivos de proteínas habituales. Otros virus pueden multiplicarse de manera notoriamente mala independientemente de la composición del medio y de las condiciones de cultivo, por ejemplo, virus de la rabia, rotavirus, pneumovirus o de la hepatitis A (Provost y Hillemann, Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 160:213-221 (1979); y Rolle y Mayr, en el lugar citado). Finalmente, en el estado de la técnica se conocen numerosos procedimientos mediante los cuales virus, productos de expresión viral u otras proteínas pueden aislarse del medio y/o de... [Seguir leyendo]

1.- Procedimiento para la preparación de un componente activo de una vacuna en ausencia de suero, comprendiendo etapas que en las que (a) se infectan células MDCK con un virus, tratándose el virus de un virus de la gripe de un aislado primario, que se multiplicó previamente en cultivo celular para obtener un virus de siembra homogéneo para fines productivos, (b) las células MDCK en cultivo en suspensión se cultivan a escala industrial en condiciones que hacen posible una multiplicación de los virus, realizándose el cultivo en un volumen de al menos 30 l. ES 2 367 833 T3 2.- Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque las células en la etapa (a) crecen adheridas o en suspensión. 3.- Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el componente activo es un virus. 4.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el virus presenta un genoma viral que comprende una secuencia que codifica una proteína heteróloga funcional con un tamaño de al menos 10 kDa. 5.- Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el componente activo es una proteína que se generó del virus. 6.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la multiplicación de los virus se lleva a cabo en un sistema de perfusión. 7.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la multiplicación de los virus se lleva a cabo en un sistema por lotes. 8.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las células MDCK se cultivan para la multiplicación de los virus a temperaturas entre 30 y 40º C. 9.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las células MDCK se cultivan para la multiplicación de los virus a una presión parcial de oxígeno entre 35 y 60%. 10.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el valor del pH del medio se encuentra para la multiplicación de los virus entre pH 6,8 y pH 7,8. 11.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las células MDCK se infectan con el virus a un valor m.o.i. entre 10 -8 y 10. 12.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las células se cultivan al menos de 2 a 28 días tras la infección. 13.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque durante el cultivo de las células MDCK se añade medio fresco, concentrado de medio o componentes del medio. 14.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las células MDCK durante la multiplicación de los virus se multiplican en medio sin suero con cambio del medio de cultivo o mediante adición de medio de cultivo fresco. 15.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se repite el cambio del medio de cultivo o la adición de medio de cultivo fresco durante la multiplicación de los virus. 16.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los virus o una proteína generada por estos virus se aíslan del cultivo celular. 17.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque para el aislamiento de los virus o de la proteína se separa al menos una parte del medio de cultivo de al menos una parte de las células MDCK. 18.- Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque la separación se realiza mediante un filtro de lecho profundo o un separador. 19.- Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque los virus se obtienen del sobrenadante de cultivo o de células MDCK. 20.- Procedimiento según la reivindicación 19, caracterizado porque la purificación comprende una ultracentrifugación para la concentración de los virus. 21 ES 2 367 833 T3 21.- Procedimiento según la reivindicación 20, caracterizado porque la purificación comprende una cromatografía. 22.- Procedimiento según la reivindicación 21, caracterizado porque los virus se inactivan durante o tras la purificación. 23.- Procedimiento para la preparación de una vacuna, en el que se genera un componente activo según un procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes y en el que se mezcla además según la etapa (c) el componente activo, que se multiplicó en el cultivo, con un adyuvante, coadyuvante, tampón, diluyente o vehículo de fármaco adecuado. 22