Procedimiento para producir un péptido modificado.

Método para producir un fragmento de péptido protegido que contiene uno o más aminoácidos o noaminoácidos modificados,

en el que al menos un aminoácido o no aminoácido está modificado tal como serepresenta mediante la fórmula 1; -A(R)-, en la que, A representa un aminoácido o un no aminoácido, y Rrepresenta un sustituyente unido a una cadena lateral de A que se introduce para modificación,

en el que el no aminoácido es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en NH2-CH(CH2OH)-CH3,CH3-CH(R11)-COOH, CH3-CH(R11)-CH3, NH2-(CH2)3CH(CH2OH)-COOH, NH2-(CH2)4-COOH, NH2-C(CH3)2-(CH2)3-COOH, NH2-CH(CH3)-(CH2)2-CH(CH3)-COOH, NH2-(CH2)3CH(CH2OH)-CH3 y NH2-(CH2)3CH(R11)-CH3 en los que R11 representa una cadena lateral de un aminoácido natural,

que comprende:

(a) preparar, en una resina a base de tritilo, un fragmento de péptido que tiene una secuencia deseada quecomprende aminoácidos o/y no aminoácidos, en el que uno o más grupos funcionales reactivos en unacadena lateral de un aminoácido o un no aminoácido que pueden producir una reacción secundaria nodeseada en la preparación de un fragmento de péptido están protegidos con un grupo protector,seleccionándose el uno o más grupos funcionales reactivos del grupo que consiste en un grupo hidroxilo,un grupo amino, un grupo guanidino, un grupo imidazolilo, un grupo indolilo, un grupo mercapto y un grupocarboxilo, y un grupo funcional reactivo en la cadena lateral de un aminoácido o un no aminoácido A que vaa modificarse con un sustituyente R se protege con un grupo protector de sililo,

(b) eliminar el grupo protector de sililo sin escindir el fragmento de péptido de la resina a base de tritilousando un fluoruro de amonio cuaternario, cuando el grupo protector de sililo se introduce en un grupofuncional reactivo en la cadena lateral de un aminoácido o un no aminoácido A que va a modificarse con unsustituyente R, en el que el grupo protector de sililo es t-butildimetilsililo (TBDMS), t-butildifenilsililo(TBDPS), triisopropilsililo (TIPS), triisobutilsililo (TIBS), t-hexildimetilsililo (ThxDMS) o trifenilsililo (TPS), y elfluoruro de amonio cuaternario es fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF), fluoruro de tetraetilamonio (TEF) ofluoruro de amonio,

(c) modificar la cadena lateral desprotegida con un sustituyente R, y

(d) escindir el fragmento de péptido de la resina a base de tritilo en condiciones débilmente ácidas usandouna disolución que contiene ácidos carboxílicos y/o alcoholes fluorados sin eliminación del grupo protector,tal como se define en la etapa (a), en el fragmento de péptido.

Procedimiento para producir un péptido modificado

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para producir una proteína o péptido modificado, y a un método para producir un fragmento de péptido protegido que contiene uno o más aminoácidos o no aminoácidos modificados, que se usa de manera adecuada para el método de producción mencionado anteriormente.

Técnica anterior

En 1999 se purificó y se aisló de estómago de rata un secretagogo de hormona de crecimiento (GHS) endógeno para un receptor de secretagogo de hormona de crecimiento (GHS-R) , que es uno de los receptores huérfanos, y se denominó ghrelina (Kojima et al., Nature, vol. 402, págs. 656-660, 1999) . Se sabe que este péptido tiene una estructura característica en la que un grupo hidroxilo de un residuo de serina está acilado con un ácido graso. Además, también se aisló ghrelina en la que un residuo de serina o un residuo de treonina en la posición 3 contiene un sitio modificado por ácido graso de un vertebrado distinto de rata, tal como ser humano, ratón, cerdo, ave, anguila, vaca, caballo, oveja, rana, trucha o perro, o se supuso a partir de ADNc (tabla 1) . Por ejemplo, la ghrelina humana consiste en 28 aminoácidos, y la cadena lateral de serina en la posición 3 está acilada con un ácido graso (ácido N-octanoico) . Se ha descubierto que este péptido novedoso tiene una fuerte actividad de secretagogo de hormona de crecimiento, y la modificación de la serina o la treonina en la posición 3 con un ácido graso es esencial para la manifestación de la actividad (Kojima et al., Nature, vol. 402, págs. 656-660, 1999) . Además, se ha aclarado que la ghrelina secretada del estómago funciona como una hormona de la sangre en la regulación de la secreción de la hormona de crecimiento, y por tanto se ha prestado mucha atención al papel fisiológico de la ghrelina y a su aplicación a medicamentos.

Tabla 1

Humana : GSS (n-octanoil) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR

: GSS (n-octanoil) FLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR

De rata : GSS (n-octanoil) FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR

: GSS (n-octanoil) FLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR

De ratón : GSS (n-octanoil) FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR

Porcina : GSS (n-octanoil) FLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR

Bovina : GSS (n-octanoil) FLSPEHQKLQRKEAKKPSGRLKPR

Ovina : GSS (n-octanoil) FLSPEHQKLQRKEPKKPSGRLKPR

Canina : GSS (n-octanoil) FLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR

De anguila : GSS (n-octanoil) FLSPSQRPQGKDKKPPRV-NH2

De trucha : GSS (n-octanoil) FLSPSQKPQVRQGKGKPPRV-NH2

: GSS (n-octanoil) FLSPSQKPQGKGKPPRV-NH2

De pollo : GSS (n-octanoil) FLSPTYKNIQQQKGTRKPTAR

: GSS (n-octanoil) FLSPTYKNIQQQKDTRKPTAR

: GSS (n-octanoil) FLSPTYKNIQQQKDTRKPTARLH

De rana toro : GLT (n-octanoil) FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM

: GLT (n-decanoil) FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM

: GLT (n-octanoil) FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMN

De tilapia : GSS (n-octanoil) FLSPSQKPQNKVKSSRI-NH2

De siluro : GSS (n-octanoil) FLSPTQKPQNRGDRKPPRV-NH2

: GSS (n-octanoil) FLSPTQKPQNRGDRKPPRVG

Equina : GSS (n-butanoil) FLSPEHHKVQHRKESKKPPAKLKPR

Además de un péptido modificado con grupo octanolilo (C8) , hay péptidos modificados con grupo butanoílo (C4) , con grupo hexanoílo (C6) , con grupo decanoílo (C10) y con grupo dodecanoílo (C12) . Además, hay péptidos modificados con ácido graso insaturado.

Algunos péptidos o proteínas, como ghrelina y colecistocinina, manifiestan su papel fisiológico cuando un residuo de aminoácido específico en la secuencia de aminoácidos ha experimentado modificación tal como acilación, sulfonación, glicosilación o fosforilación. Se cree que estas modificaciones se producen por un elaborado sistema enzimático en un organismo vivo, y todavía no se ha notificado un método general para producir una proteína o péptido modificado de una manera eficaz y con alta calidad en grandes cantidades. Por ejemplo, puesto que la ghrelina muestra actividad de secretagogo de hormona de crecimiento mediante la modificación de una cadena lateral de aminoácido específico con un ácido graso de cadena larga, la modificación con ácidos grasos es un elemento estructural esencial. Sin embargo, todavía no se sabe qué sistema enzimático de un organismo vivo está implicado para la unión de tipo éster de un ácido graso a un grupo hidroxilo de una cadena lateral de aminoácido específico o para la extensión de un ácido graso. Puesto que en particular, la ghrelina es el primer péptido fisiológicamente activo que se ha aclarado que tiene una estructura en la que un grupo hidroxilo de una cadena lateral de aminoácido está modificado con un ácido graso, aunque el presente péptido es una hormona peptídica útil que se espera que sea un medicamento prometedor como medicina curativa para trastornos de la alimentación, un fármaco para promover la secreción de hormonas de crecimiento, etc., no se ha generalizado la producción de un péptido que tenga una modificación con ácido graso en una cadena lateral de aminoácido específico que contiene hidroxilo. Es decir, en la actualidad no se ha establecido un método de producción industrial que sea ventajoso para la producción en masa de un péptido de este tipo.

Actualmente, se usan como medicamento diversas preparaciones de péptido o proteína tales como insulina, hormona de crecimiento, calcitonina, péptido natriurético auricular, derivado de LH-RH y derivado de hormona adrenocorticotrópica. Como método para producir estos péptidos o proteínas, se conoce la producción mediante un método de síntesis química, un método enzimático y un método de recombinación genética. Sin embargo, en cuanto a la selección apropiada de qué método emplear, generalmente se selecciona un método de síntesis química cuando el número de residuos es pequeño, y se selecciona un método enzimático o un método de recombinación genética cuando el número de residuos es grande.

Un método de síntesis química, por ejemplo, es un método mediante el cual puede producirse de manera continua un péptido o proteína fisiológicamente activos que tienen una modificación tal como ghrelina, etc. Ya se han notificado muchos métodos de producción que usan un método de síntesis química como un método para producir una proteína o péptido modificado. Se han descrito métodos de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) en Shapiro et al. (Tetrahedron Letters, 35, 869-872 (1994) ) y Fischer (Tetrahedron Letters, 33, 7605-7608 (1992) ) . Shapiro et al. (loc. cit.) describen además la síntesis en fase sólida de péptidos que comprenden un aminoácido modificado, más específicamente fosfoserina. En ambas publicaciones, se producen de manera concomitante la escisión de la resina y la desprotección de los péptidos. En el caso de la ghrelina se notifican métodos por Bednarek et al. (J. Med. Chem., vol. 43, págs. 4370-4376, 2000) y Matsumoto et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 284, págs. 655-659, 2001) . Además, la publicación internacional n.º WO 01/07475 describe un método de producción mediante un método de síntesis química, como un método para producir un péptido que es ghrelina o un derivado de ghrelina, o una sal de los mismos. Sin embargo, en una producción mediante un método de síntesis química, habitualmente hay una limitación a la longitud de cadena del péptido que puede sintetizarse, mientras se mantiene una calidad constante (pureza) . Aunque un método de síntesis química en fase líquida puede sintetizar un péptido de alta pureza, el método no es común para la síntesis de un péptido de cadena larga debido a la solubilidad, la larga etapa de producción y las técnicas especiales necesarias para el tratamiento de la reacción. Concretamente, la producción eficaz en grandes cantidades es difícil en un método de producción que usa un método de síntesis química en fase líquida. Por otra parte, la síntesis química en fase sólida para extender una cadena peptídica en una resina tiene una etapa simplificada, y es más ventajosa para la producción en masa, pero este método también tiene una limitación en la longitud de cadena que puede construirse para obtener productos deseados que tengan calidad constante. Además, también está el problema de que el método es inferior en propiedades económicas debido a los excesivos reactivos usados, en particular, en la producción de un péptido de cadena larga.

Mientras tanto, un método para acoplar enzimáticamente un fragmento de péptido tal como un método enzimático, es excelente porque puede minimizarse la protección de una cadena lateral de aminoácido. En este método, sin embargo, puesto que habitualmente se usa una reacción inversa de hidrólisis, el ajuste de las condiciones es en principio difícil,... [Seguir leyendo]

1. Método para producir un fragmento de péptido protegido que contiene uno o más aminoácidos o no aminoácidos modificados, en el que al menos un aminoácido o no aminoácido está modificado tal como se representa mediante la fórmula 1; -A (R) -, en la que, A representa un aminoácido o un no aminoácido, y R representa un sustituyente unido a una cadena lateral de A que se introduce para modificación,

en el que el no aminoácido es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en NH2-CH (CH2OH) -CH3, CH3-CH (R11) -COOH, CH3-CH (R11) -CH3, NH2- (CH2) 3CH (CH2OH) -COOH, NH2- (CH2) 4-COOH, NH2-C (CH3) 2 (CH2) 3-COOH, NH2-CH (CH3) - (CH2) 2-CH (CH3) -COOH, NH2- (CH2) 3CH (CH2OH) -CH3 y NH2- (CH2) 3CH (R11) -CH3 en los que R11 representa una cadena lateral de un aminoácido natural,

que comprende:

(a) preparar, en una resina a base de tritilo, un fragmento de péptido que tiene una secuencia deseada que comprende aminoácidos o/y no aminoácidos, en el que uno o más grupos funcionales reactivos en una cadena lateral de un aminoácido o un no aminoácido que pueden producir una reacción secundaria no deseada en la preparación de un fragmento de péptido están protegidos con un grupo protector, seleccionándose el uno o más grupos funcionales reactivos del grupo que consiste en un grupo hidroxilo, un grupo amino, un grupo guanidino, un grupo imidazolilo, un grupo indolilo, un grupo mercapto y un grupo carboxilo, y un grupo funcional reactivo en la cadena lateral de un aminoácido o un no aminoácido A que va a modificarse con un sustituyente R se protege con un grupo protector de sililo,

(b) eliminar el grupo protector de sililo sin escindir el fragmento de péptido de la resina a base de tritilo usando un fluoruro de amonio cuaternario, cuando el grupo protector de sililo se introduce en un grupo funcional reactivo en la cadena lateral de un aminoácido o un no aminoácido A que va a modificarse con un sustituyente R, en el que el grupo protector de sililo es t-butildimetilsililo (TBDMS) , t-butildifenilsililo (TBDPS) , triisopropilsililo (TIPS) , triisobutilsililo (TIBS) , t-hexildimetilsililo (ThxDMS) o trifenilsililo (TPS) , y el fluoruro de amonio cuaternario es fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF) , fluoruro de tetraetilamonio (TEF) o fluoruro de amonio,

(c) modificar la cadena lateral desprotegida con un sustituyente R, y

(d) escindir el fragmento de péptido de la resina a base de tritilo en condiciones débilmente ácidas usando una disolución que contiene ácidos carboxílicos y/o alcoholes fluorados sin eliminación del grupo protector, tal como se define en la etapa (a) , en el fragmento de péptido.

2. Método para producir un fragmento de péptido protegido según la reivindicación 1, en el que el grupo protector de grupo a-amino en el fragmento de péptido se selecciona del grupo que consiste en un grupo alcoxicarbonilo que tiene opcionalmente un sustituyente, un grupo cicloalquiloxicarbonilo que tiene opcionalmente un sustituyente, un grupo aralquiloxicarbonilo que tiene opcionalmente un sustituyente, un grupo aralquilo que tiene opcionalmente un sustituyente, un grupo acilo que tiene opcionalmente un sustituyente, ditiasuccinoílo, 2-nitrofeniltio, difenilfosfinilo, difenilfosfinotioílo y dimetilfosfinotioílo;

el grupo protector del grupo hidroxilo en el fragmento de péptido se selecciona del grupo que consiste en un grupo alcanoílo inferior que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo aroílo, un grupo benciloxicarbonilo y un grupo etoxicarbonilo;

el grupo protector del grupo guanidino de arginina en el fragmento de péptido se selecciona del grupo que consiste en un grupo nitro, un grupo benciloxicarbonilo, un grupo p-toluenosulfonilo, un grupo pmetoxibencenosulfonilo, un grupo 4-metoxi-2, 6-dimetilbencenosulfonilo, un grupo 4-metoxi-2, 3, 6trimetilbencenosulfonilo, un grupo mesitilen-2-sulfonilo, un grupo 2, 3, 4, 5, 6-pentametilbencenosulfonilo, un grupo 2, 4, 6-trimetoxibencenosulfonilo, un grupo 2, 2, 5, 7, 8-pentametilcromano-6-sulfonilo y un grupo 2, 2, 4, 6, 7-pentametil-dihidrobenzofurano-5-sulfonilo;

el grupo protector del grupo mercapto de cisteína en el fragmento de péptido se selecciona del grupo que consiste en un grupo tritilo, un grupo acetamidometilo, un grupo terc-butilo, un grupo bencilo, un grupo pmetilbencilo, un grupo p-metoxibencilo, un grupo 3-nitro-2-piridinsulfenilo y un grupo butiltio;

el grupo protector del grupo imidazolilo de histidina en el fragmento de péptido se selecciona del grupo que consiste en un grupo t-butoxicarbonilo, un grupo tritilo, un grupo p-toluenosulfonilo, un grupo 4-metoxi-2, 3, 6trimetilbencenosulfonilo, un grupo 2, 4-dinitrofenol, un grupo benciloximetilo, un grupo t-butoximetilo y un grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo;

el grupo protector del grupo indolilo de triptófano en el fragmento de péptido se selecciona del grupo que consiste en un grupo formilo, un grupo benciloxicarbonilo, un grupo 2, 4-diclorobenciloxicarbonilo, un grupo tricloroetiloxi-carbonilo, un grupo 4-metoxi-2, 3, 6-trimetilbencenosulfonilo y un grupo 2, 4, 6trimetoxibencenosulfonilo; y

el grupo protector del grupo carboxilo en el fragmento de péptido se selecciona del grupo que consiste en un grupo éster alquílico, un grupo éster aralquílico, un grupo éster fenacílico, un grupo benciloxicarbonilhidrazida, un grupo t-butoxicarbonilhidrazida y un grupo tritilhidrazida.

3. Método para producir un fragmento de péptido según la reivindicación 2, en el que el grupo alcoxicarbonilo que tiene opcionalmente un sustituyente es t-butoxicarbonilo, tricloroetiloxicarbonilo, t-amiloxicarbonilo, 9fluorenilmetoxicarbonilo, metilsulfoniletoxicarbonilo, tricloroetoxicarbonilo, 2- (trimetilsilil) etoxicarbonilo o piridin-4-metoxicarbonilo;

el grupo cicloalquiloxicarbonilo que tiene opcionalmente un sustituyente es cicloheptiloxicarbonilo o ciclohexiloxicarbonilo;

el grupo aralquiloxicarbonilo que tiene opcionalmente un sustituyente es benciloxicarbonilo, pmetoxibenciloxicarbonilo, p-clorobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, 2-fenilisopropiloxicarbonilo, p-metilfenilisopropiloxicarbonilo, pbifenilisopropiloxicarbonilo o 3, 5-dimetoxi-a, a-dimetilbenciloxicarbonilo;

el grupo aralquilo que tiene opcionalmente un sustituyente es bencilo, benzhidrilo o tritilo;

el grupo acilo que tiene opcionalmente un sustituyente es trifluoroacetilo, ftaloílo, formilo, bencenosulfonilo, p-toluenosulfonilo, o-nitrofenilsulfenilo, 2, 4-dinitrofenilsulfenilo o 3-nitro-2-piridilsulfenilo;

el grupo alcanoílo inferior que tiene de 1 a 6 átomos de carbono es un grupo acetilo;

el grupo aroílo es un grupo benzoílo;

el grupo éster alquílico es éster metílico, éster etílico, éster propílico, éster butílico, éster t-butílico, éster ciclopentílico, éster ciclohexílico, éster cicloheptílico, éster ciclooctílico o éster 2-adamantílico; y

el grupo éster aralquílico es el grupo éster bencílico, éster 4-nitrobencílico, éster 4-metoxibencílico, éster 4clorobencílico o éster benzhidrílico.

4. Método para producir un fragmento de péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la resina a base de tritilo es resina de 2-clorotritilo, resina de tritilo, resina de 4-metiltritilo, resina de 4metoxitritilo o resina de Rink Barlos.

5. Método para producir un fragmento de péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el grupo protector de sililo es t-butildimetilsililo (TBDMS) .

6. Método para producir un fragmento de péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el fluoruro de amonio cuaternario es fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF) .

7. Método para producir un fragmento de péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que los ácidos carboxílicos son ácido acético, ácido trifluoroacético o ácido fórmico y los alcoholes fluorados son trifluoroetanol o hexafluoroisopropanol.

8. Método para producir un fragmento de péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que A es serina, treonina, cisteína, homocisteína, lisina, ornitina, ácido glutámico, ácido 2-aminoadípico, ácido diaminoacético, ácido 2-aminomalónico, ácido aspártico, tirosina o asparagina, y R está unido a un sustituyente reactivo en la cadena lateral de A a través de un enlace éster, un enlace éter, un enlace tioéter, un enlace disulfuro, un enlace amida, un enlace O-glicosídico o un enlace N-glicosídico.

9. Método para producir un fragmento de péptido según la reivindicación 8, en el que A es serina o treonina, y R está unido al grupo hidroxilo en la cadena lateral de A a través de un enlace éster.

10. Método para producir un fragmento de péptido según la reivindicación 9, en el que el fragmento de péptido es ghrelina o un derivado de la misma, o un fragmento de péptido que contiene un aminoácido modificado en la ghrelina o un derivado del mismo.

11. Método para producir una proteína o péptido modificado, que comprende

(a) preparar un fragmento de péptido protegido que contiene uno o más aminoácidos o no aminoácidos modificados mediante el método descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10,

(b) preparar un fragmento de péptido que contiene aminoácido no modificado o no aminoácido modificado, y en el que uno o más grupos funcionales reactivos que pueden producir una reacción secundaria no deseada, seleccionados del grupo que consiste en un grupo hidroxilo, un grupo amino, un grupo guanidino, un grupo imidazolilo, un grupo indolilo, un grupo mercapto y un grupo carboxilo, en la cadena lateral de un aminoácido o un no aminoácido, están protegidos, además del fragmento de péptido de (a) , y

(c) condensar fragmentos de péptido preparados en (a) y (b) .

12. Método para producir una proteína o péptido modificado según la reivindicación 11, en el que la condensación de los fragmentos de péptido se realiza mediante el uso de un agente de condensación.

13. Método para producir una proteína o péptido modificado según la reivindicación 12, en el que el agente de condensación es hexafluorofosfato de 2- (1-hidrobenzotriazol-1-il) -1, 1, 3, 3-tetrametiluronio (HBTU) , tetrafluoroborato de 2- (1-hidrobenzotriazol-1-il) -1, 1, 3, 3-tetrametiluronio (TBTU) , difenilfosforilazida (DPPA) , difenilfosforocianidato (DEPC) , diisopropilcarbodiimida (DIPC) , diciclohexilcarbodiimida (DCC) o 1-etil-3- (3dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) .

14. Método para producir una proteína o péptido modificado según la reivindicación 12, en el que el agente de condensación es diisopropilcarbodiimida (DIPC) , diciclohexilcarbodiimida (DCC) o 1-etil-3- (3dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) , y la condensación de los fragmentos de péptido (a) y (b) usando el agente de condensación se realiza en presencia de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) , 1-hidroxisuccinimida (HOSu) o 3, 4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-benzotriazina (HOOBt) .

15. Método para producir una proteína o péptido modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, que comprende producir un fragmento de péptido protegido que no contiene aminoácido o no aminoácido modificado, mediante un método enzimático o/y un método de recombinación genética.

16. Método para producir una proteína o péptido modificado según la reivindicación 13, en el que el fragmento de péptido protegido que no contiene aminoácido o no aminoácido modificado se produce mediante un método que comprende:

etapa (1) : una etapa de poner en cultivo una célula transformada con un vector de expresión que tiene una de una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos del fragmento de péptido (denominado a continuación en el presente documento péptido deseado, en la presente reivindicación 16) y una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de fusión opcionalmente con un péptido protector añadido al péptido deseado a través de una secuencia de ligador, y recoger la proteína de fusión o el péptido deseado del cultivo;

etapa (2) : una etapa de escindir y separar el péptido protegido y, opcionalmente, la secuencia de ligador y el péptido deseado de la proteína de fusión resultante, y opcionalmente purificar adicionalmente el péptido deseado cuando la proteína de fusión se recoge en la etapa (1) ; y

etapa (3) : una etapa de proteger, con un grupo protector, uno o más grupos funcionales reactivos que pueden producir una reacción secundaria no deseada, seleccionados del grupo que consiste en un grupo hidroxilo, un grupo amino, un grupo guanidino, un grupo imidazolilo, un grupo indolilo, un grupo mercapto y un grupo carboxilo, en la cadena lateral del péptido deseado obtenido en la etapa (1) o en la etapa (2) .

17. Método para producir una proteína o péptido modificado según la reivindicación 16, en el que la escisión y separación del péptido protector y, opcionalmente, la secuencia de ligador y el péptido deseado en la etapa (2) se realiza en dos etapas usando una proteasa OmpT o un derivado de la misma y la proteasa Kex2 o un derivado de la misma.

18. Método para producir una proteína o péptido modificado según la reivindicación 16 ó 17, en el que la secuencia de ligador es una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 27.

19. Método para producir una proteína o péptido modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en el que el fragmento de péptido es un fragmento de péptido que contiene aminoácido no moficado o no aminoácidoen ghrelina o un derivado de la misma.

20. Método para producir una proteína o péptido modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en el que el fragmento de péptido protegido que no contiene aminoácido o no aminoácido modificado se purifica y almacena en una disolución que tiene un pH de 4 a 8.

21. Método para producir una proteína o péptido modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en el que el grupo protector es un grupo Boc.