PROCEDIMIENTO PARA LA PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS.

La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para la proliferación o cultivo de células. Antecedentes de la invención Los defectos o lesiones en la superficie articular se pueden clasificar como lesiones o defectos condrales y osteocondrales, dependiendo de si penetran o no en el hueso subcondral. Las lesiones condrales, también conocidas como lesiones de cartílago, son desde hace muchos años un problema de difícil solución. El cartílago es una forma especializada de tejido conjuntivo que se encuentra en el adulto en las articulaciones, costillas, orejas, tabique nasal y tracto respiratorio. El cartílago articular permite que los huesos se deslicen unos sobre otros. También absorbe la tensión que produce el movimiento físico. La artrosis se caracteriza por una degeneración del cartílago articular, lo cual provoca que los huesos se rocen unos contra otros, produciendo dolor, hinchazón y pérdida de movimiento en la articulación. Con el paso del tiempo la articulación puede deformarse. Numerosos estudios han confirmado que el cartílago, huesos y partes blandas tales como ligamentos y tendones, especialmente en personas adultas, presentan una capacidad limitada de regeneración. En condiciones normales, la renovación del cartílago es un proceso muy lento que consiste en una constante síntesis (anabolismo) y degradación (catabolismo) de los componentes de la matriz extracelular. Los condrocitos son las células responsables de este metabolismo, y por lo tanto, de la formación, mantenimiento y reparación de la matriz extracelular en la que se encuentran inmersos. En 1987 se llevó a cabo en Suecia el primer implante de condrocitos autólogos en humanos (técnica ACI), como una alternativa terapéutica a otros tratamientos para reparar defectos de cartílago. La articulación más frecuentemente tratada mediante esta técnica es la rodilla. El implante de condrocitos autólogos es una técnica que se realiza en dos tiempos. En una primera intervención quirúrgica se extraen láminas de cartílago articular. Esta muestra se cultiva hasta alcanzar un número suficiente de condrocitos para el implante. En una segunda intervención quirúrgica se extraen los trozos sueltos de tejido y se cubre con un parche de periostio al que se deja una pequeña apertura para inyectar los condrocitos cultivados. Una vez implantados los condrocitos, se cierra y se sella el periostio. Recientemente se ha descrito la utilización de una membrana de colágeno tipo I/III en lugar del periostio (C.R. Gooding et al., The Knee, 13 (3), 203-210 (2006)). Desde el primer implante de condrocitos autólogos en humanos, el interés por el tratamiento o reparación de defectos o lesiones de cartílago utilizando células ha ido en aumento. En 1994 se publicó un estudio clínico en el que se había utilizado la técnica ACI. Dicho estudio se llevó a cabo con 23 pacientes con defectos de cartílago en la rodilla (M. Brittberg et al., N. Engl. J. Med., 331, 889-895 (1994)). En numerosas publicaciones se describen nuevos procedimientos de proliferación de condrocitos mediante la utilización de diversas matrices o estructuras (scaffolds) o bien de medios de cultivo alternativos a los convencionales (WO 2005/082433; WO 2005/054446; K.F. Almqvist et al., Ann. Rheum. Dis., 60, 781-790 (2001)). El tejido óseo es un tejido conjuntivo especializado que, como los restantes tejidos conjuntivos, está formado por células, fibras y sustancia fundamental, pero, a diferencia de los otros, sus componentes extracelulares están calcificados y le convierten en un material duro, firme y adecuado para su función de soporte y protección. Proporciona apoyo interno al cuerpo y ofrece lugares de inserción a los músculos y tendones que son esenciales para el movimiento. En los huesos que crecen activamente se distinguen cuatro tipos de células óseas: células osteoprogenitoras, osteoblastos, osteocitos y osteoclastos. Las células osteoprogenitoras son células que se originan a partir de células mesenquimales y pueden proliferar y diferenciarse únicamente hacia osteoblastos u osteoclastos. Los osteoblastos están involucrados en la formación de hueso. Los defectos óseos representan un gran reto médico y socio-económico. Actualmente se están desarrollando y aplicando diferentes tipos de biomateriales para la reconstrucción de los tejidos óseos dañados. (U. Kneser, et al, Tissue engineering of bone: the reconstructive surgeons point of view, J. Cell. Mol. Med. 10 (1), 7-19 (2006)). 2   La D-manosamina (2-amino-2-desoxi-D-manosa) es un aminoazúcar que se utiliza en la síntesis del ácido siálico y derivados. Existen documentos en los que se menciona o describe la proliferación de condrocitos mediante la utilización de otros aminoazúcares. En la solicitud de patente PCT WO2004/104183 se reivindica el cultivo de condrocitos en presencia del aminoazúcar glucosamina. En la patente US 6479469 se describe el incremento en la proliferación de condrocitos cuando se utiliza un Nacilderivado de glucosamina. Por todo lo dicho, el problema a solucionar por la presente invención es proporcionar un procedimiento alternativo para la proliferación o cultivo de células de tejido conjuntivo y en particular de condrocitos, así como proporcionar composiciones alternativas para ser utilizadas en el tratamiento de defectos o lesiones de cartílago, pérdidas de masa ósea, lesiones de los huesos y lesiones osteocondrales. Explicación de la invención La presente invención describe un procedimiento in vitro para la proliferación de células de tejido conjuntivo denominadas condrocitos, que comprende la etapa de poner en contacto dichos condrocitos con un aminoazúcar seleccionado de entre el grupo que consiste en manosamina, N-acetilmanosamina, sales de manosamina o sus mezclas, en el que los condrocitos se encuentran en una matriz soporte biocompatible. En una realización preferida, la matriz soporte biocompatible comprende un material polimérico y es adecuada para el implante en el cuerpo humano o animal. En una realización preferida, la matriz soporte biocompatible es una matriz soporte de alginato. En una realización más preferida, el aminoazúcar es clorhidrato de manosamina. Preferentemente los aminoazúcares manosamina, N-acetilmanosamina y sales de manosamina utilizados en la presente invención son de la serie D. Dichos aminoazúcares pueden existir en formas anoméricas y ß. La presente invención incluye la utilización tanto de los anómeros individuales y ß separados como de sus mezclas. Las sales de manosamina con ácidos farmacéuticamente aceptables, incluye, sin límite, las sales con los siguientes ácidos: ácido clorhídrico, yodhídrico, bromhídrico, fosfórico, sulfúrico, metanosulfónico, acético, fórmico, tartárico, maleico, cítrico, succínico, láctico, glucónico, pirúvico, fumárico, propiónico, aspártico, glutámico, benzoico, ascórbico, glucurónico y málico. Las sales de manosamina se pueden preparar siguiendo procedimientos estándares de preparación de sales de aminoazúcares. Un procedimiento consiste en obtener previamente la manosamina base a partir del clorhidrato de manosamina, para después añadir el ácido correspondiente dependiendo de la sal que se desee obtener. Otro procedimiento consiste en obtener las sales directamente a partir del clorhidrato de manosamina utilizando una resina de intercambio aniónico previamente acondicionada con el ácido que contiene el anión de la sal que se desea obtener o bien una sal de metal del ácido. También se pueden obtener utilizando la técnica de electrodiálisis. El clorhidrato de manosamina es un producto comercial (NZP, New Zealand Pharmaceutical), pero si se desea se puede preparar mediante la epimerización de la N-acetilglucosamina con una disolución acuosa de Ca(OH)2 seguida de separación de los isómeros, tratamiento con ácido clorhídrico, decoloración y precipitación con solventes (Sugai et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 68, 3581-3589 (1995); Sugai et al., Tetrahedron, 53 (7), 2397-2400 (1997)). Cuando en la presente invención se habla de procedimiento in vitro, también se está incluyendo el procedimiento denominado ex vivo. Cuando en la presente invención se habla de células condroprogenitoras y de células osteoprogenitoras se hace referencia a células que ya han conseguido una diferenciación parcial y que han perdido la capacidad pluripotencial de la célula madre. Es decir, son células que en su progresión evolutiva, se han comprometido con un determinado linaje celular para dar lugar a células especializadas específicas. Así, las células condroprogenitoras darán lugar a condrocitos. 3   Cuando en la presente invención se habla de matrices soporte se incluyen también las denominadas estructuras soporte (support scaffolds). Preferentemente las matrices o estructuras soporte biocompatibles utilizadas... [Seguir leyendo]

1.- Procedimiento in vitro para la proliferación de condrocitos, que comprende la etapa de poner en contacto dichos condrocitos con un aminoazúcar seleccionado de entre el grupo que consiste en manosamina, N-acetilmanosamina, sales de manosamina y sus mezclas, en el que los condrocitos se encuentran en una matriz soporte biocompatible. 2.- El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la matriz soporte biocompatible comprende un material polimérico. 3.- El procedimiento según la reivindicación 2, en el que la matriz soporte biocompatible es una matriz soporte de alginato. 4.- El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la matriz soporte biocompatible es adecuada para el implante en el cuerpo humano o animal. 5.- El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el aminoazúcar es clorhidrato de manosamina. 9   HCl Glu = clorhidrato de glucosamina N-AGlu = N-Acetilglucosamina HCl Man = clorhidrato de manosamina % de GAGs liberados ANOVA: p< 0,001 FIGURA 1 HCl Glu = clorhidrato de glucosamina N-AGlu = N-Acetilglucosamina * HCl Glu N-AGlu HCl Man HCl Man = clorhidrato de manosamina FIGURA 2 * * 0mM 1mM 10mM   actividad MMP (RFU/s) ANOVA: p< 0,001 * HCl Glu = clorhidrato de glucosamina N-AGlu = N-Acetilglucosamina HCl Man = clorhidrato de manosamina FIGURA 3 µg GAGs/µg ADN 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 N-AGlu = N-Acetilglucosamina N-Aman = N-Acetilmanosamina * HCl Glu N-AGlu HCL Man ANOVA: p< 0,001 N-AGlu N-AMan 11 * FIGURA 4 * * 0mM 5mM 10mM 0mM 5mM 10mM