Procedimiento para la detección de analitos.

Procedimiento para la detección de analitos de muestras biológicas,

que comprende las siguientes etapas deprocedimiento:

a) proporcionar una pareja de unión reversible 1 inmovilizada en una fase sólida, a la que está unida demanera reversible un ligando de analito a través de una pareja de unión reversible 2 unida al ligando deanalito, inmovilizándose el ligando de analito mediante la unión entre las parejas de unión reversible 1 y 2,

b) añadir la muestra biológica y unir el analito al ligando de analito inmovilizado de manera reversible en elcaso de que la muestra biológica contenga el analito,

c) separar la muestra biológica,

d) añadir un tampón de separación, que rompe la unión entre las parejas de unión reversible 1 y 2,manteniéndose opcionalmente la unión del analito al ligando de analito, y conteniendo el tampón deseparación un componente marcado adicional necesario para la detección, que es un segundo ligando deanalito para la realización de un inmunoensayo de tipo sándwich, y

e) detectar el analito en el tampón de separación en el caso de que la muestra biológica contenga el analito oestablecer la ausencia del analito, en el caso de que la muestra biológica no contenga el analito.

Procedimiento para la detección de analitos.

El objetivo de la presente invención es un procedimiento para la detección de analitos de muestras biológicas que comprende las siguientes etapas de procedimiento:

a) proporcionar una pareja de unión reversible 1 inmovilizada en una fase sólida, a la que está unida de manera reversible un ligando de analito a través de una pareja de unión reversible 2 unida al ligando de analito, inmovilizándose el ligando de analito mediante la unión entre las parejas de unión reversible 1 y 2,

b) añadir la muestra biológica y unir el analito al ligando de analito inmovilizado de manera reversible en el caso de que la muestra biológica contenga el analito,

c) separar la muestra biológica,

d) añadir un tampón de separación, que rompe la unión entre las parejas de unión reversible 1 y 2, manteniéndose opcionalmente la unión del analito al ligando de analito, y conteniendo el tampón de separación un componente marcado adicional necesario para la detección, que es un segundo ligando de analito para la realización de un inmunoensayo de tipo sándwich, y

e) detectar el analito en el tampón de separación en el caso de que la muestra biológica contenga el analito o establecer la ausencia del analito en el caso de que la muestra biológica no contenga el analito.

Se han desarrollados procedimientos de prueba rápida o de point-of-care (POC, en el punto de atención) en diversas tecnologías (1) . Sin embargo, muy pocos de éstos han conseguido establecerse en el mercado.

Los procedimientos de prueba rápida establecidos hoy en día, tal como por ejemplo el sistema TRIAGE (Biosite, San Diego, EE.UU.) , pero en particular el procedimiento más extendido, la inmunocromatografía, presentan de manera desventajosa con respecto a los inmunoensayos clásicos (ya sean de operación manual o automatizada) una menor sensibilidad analítica así como una precisión reducida, pero de manera ventajosa pueden procesar, en todo caso en formas de realización adecuadas, muestras de sangre completa sin procesar (2) - (7) .

Las desventajas se basan sobre todo en la dependencia de la matriz de la muestra de los procedimientos y la limitación del volumen de muestra que puede utilizarse.

Por tanto, el objetivo de la presente invención es desarrollar un procedimiento que puede realizarse entre otros como prueba rápida, que pueda procesar muestras de sangre completa sin procesar y que presente precisión y sensibilidad analítica, que sea comparable con las de los inmunoensayos clásicos.

El objetivo de la presente invención es en particular la utilización de un sistema de unión reversible según la invención para la inmovilización de un ligando específico para un analito, por ejemplo un anticuerpo anti-PCT.

Por consiguiente, el objetivo de la presente invención es un procedimiento para la detección de analitos de muestras biológicas que comprende las siguientes etapas de procedimiento:

a) proporcionar una pareja de unión reversible 1 inmovilizada en una fase sólida, a la que está unida de manera reversible un ligando de analito a través de una pareja de unión reversible 2 unida al ligando de analito, inmovilizándose el ligando de analito mediante la unión entre las parejas de unión reversible 1 y 2,

b) añadir la muestra biológica y unir el analito al ligando de analito inmovilizado de manera reversible en el caso de que la muestra biológica contenga el analito,

c) separar la muestra biológica,

d) añadir un tampón de separación, que rompe la unión entre las parejas de unión reversible 1 y 2, manteniéndose opcionalmente la unión del analito al ligando de analito, y conteniendo el tampón de separación un componente marcado adicional necesario para la detección, que es un segundo ligando de analito para la realización de un inmunoensayo de tipo sándwich, y

e) detectar el analito en el tampón de separación en el caso de que la muestra biológica contenga el analito o establecer la ausencia del analito en el caso de que la muestra biológica no contenga el analito.

El experto en la materia tiene claro que entre la etapa b) y c) debe respetarse un cierto tiempo de incubación. El tiempo de incubación debe ascender a no menos de 30 s y no más de 24 h, en el contexto de un procedimiento de prueba rápida se prefiere especialmente un tiempo de incubación de entre 5 y 15 min. El proceso de separación según la etapa d) puede ascender preferentemente a hasta 24 h, en el contexto de un procedimiento de prueba rápida el proceso de separación es preferentemente más largo de 15 s y más corto de 15 min., preferentemente de entre 5 y 15 min.

La unión del analito al ligando de analito se mantiene o no durante y/o tras la separación según d) . Ambas opciones son concebibles según la invención. Preferentemente durante y/o tras la adición del tampón de separación según d) se mantiene la unión entre el analito y el ligando de analito. La unión se mantiene preferentemente en al menos el 90% de las moléculas de analito. En caso de que la unión no se mantenga, preferentemente se produce de nuevo en un momento posterior. Lo más preferentemente en el momento de la detección existe unión entre el analito y el ligando de analito, es decir, que o bien se mantiene durante el proceso de separación o bien se produce de nuevo.

En una forma de realización preferida el ligando de analito es un anticuerpo anti-analito.

En una forma de realización preferida del procedimiento según la invención el líquido biológico es una muestra de sangre completa sin procesar.

Según la invención la pareja de unión reversible inmovilizada 1 puede inmovilizarse directamente o por medio de una proteína portadora. Una proteína portadora a modo de ejemplo es BSA (albúmina sérica bovina) . El experto en la materia conoce proteínas portadoras adecuadas.

Según la invención son adecuadas diferentes parejas de unión, que pueden formar uniones firmes, pero en ciertas condiciones pueden liberar esta unión y por consiguiente representan un “sistema de unión reversible”. En este caso son de especial interés los sistemas de unión en los que la unión puede desestabilizarse mediante condiciones relativamente suaves, es decir condiciones que no afectan negativamente de manera esencial a la conformación de proteínas, en especial anticuerpos, y su unión con un antígeno.

El empleo de tales sistemas de unión reversible se conoce en relación con las posibilidades de purificación de proteínas recombinantes a partir de mezclas complejas de proteínas tales como por ejemplo extractos celulares. Por medio de tecnología de ADN recombinante se añade en este contexto a la secuencia de ADNc que codifica para la proteína de interés una secuencia, que codifica para una denominada etiqueta (“tag”) , de modo que se expresa una proteína alargada en una “etiqueta”. A través de una pareja de unión inmovilizada en una fase sólida para la “etiqueta” puede unirse entonces selectivamente la proteína con “etiqueta” de la mezcla de proteínas y a continuación separarse de nuevo de la fase sólida mediante una desestabilización específica de la unión de “etiqueta”. La proteína de interés se encuentra entonces enriquecida o pura en disolución. Revisiones con respecto a “etiquetas” comunes, parejas de unión inmovilizadas correspondientes y procedimientos de desestabilización específicos se encuentran por ejemplo en (8) - (10) .

Tales sistemas de unión pueden utilizarse en el contexto de la presente invención como parejas de unión.

En el contexto del procedimiento según la invención el par de unión de parejas de unión reversible 1 y 2 puede seleccionarse en particular de uno de los siguientes pares de unión:

a) oligómeros peptídicos cargados positiva y negativamente,

b) péptido/proteína de unión a Ca2+ y anticuerpo, que se une al péptido/la proteína con mayor afinidad cuando el péptido/la proteína se ha unido al Ca2+,

c) oligohistidina (por ejemplo 6His) y Ni-NTA,

d) biotina y avidina o estreptavidina o neutravidina.

Ahora se presentan brevemente algunos sistemas de unión reversible, que se encuentran en el contexto de la presente invención:

Un ejemplo de un péptido/una proteína de unión a Ca2+ y un anticuerpo, que se une al péptido/la proteína con mayor afinidad cuando el péptido/la proteína se ha unido al Ca2+, es el sistema FLAG/M1, siendo el péptido/la proteína de unión a Ca2+ un péptido FLAG y el anticuerpo un anticuerpo M1. En otro sistema el péptido/proteína de unión a Ca2+ es un péptido... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la detección de analitos de muestras biológicas, que comprende las siguientes etapas de procedimiento:

a) proporcionar una pareja de unión reversible 1 inmovilizada en una fase sólida, a la que está unida de manera reversible un ligando de analito a través de una pareja de unión reversible 2 unida al ligando de analito, inmovilizándose el ligando de analito mediante la unión entre las parejas de unión reversible 1 y 2,

b) añadir la muestra biológica y unir el analito al ligando de analito inmovilizado de manera reversible en el caso de que la muestra biológica contenga el analito,

c) separar la muestra biológica,

d) añadir un tampón de separación, que rompe la unión entre las parejas de unión reversible 1 y 2, manteniéndose opcionalmente la unión del analito al ligando de analito, y conteniendo el tampón de separación un componente marcado adicional necesario para la detección, que es un segundo ligando de analito para la realización de un inmunoensayo de tipo sándwich, y

e) detectar el analito en el tampón de separación en el caso de que la muestra biológica contenga el analito o establecer la ausencia del analito, en el caso de que la muestra biológica no contenga el analito.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el líquido biológico es una muestra de sangre completa sin procesar.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la pareja de unión reversible inmovilizada 1 está inmovilizada directamente o por medio de una proteína portadora.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ligando de analito está unido covalentemente a la pareja de unión reversible 2.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el ligando de analito es un anticuerpo antiprocalcitonina.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el par de unión de parejas de unión reversible 1 y 2 se selecciona de entre uno de los siguientes pares de unión: a) oligómeros peptídicos cargados positiva y negativamente, b) péptido/proteína de unión a Ca2+ y anticuerpo, que se une al péptido/la proteína con mayor afinidad cuando el péptido/la proteína se ha unido al Ca2+,

c) oligohistidina (por ejemplo 6His) y Ni-NTA, d) biotina y avidina o estreptavidina o neutravidina.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el péptido/la proteína de unión a Ca2+ es un péptido FLAG y el anticuerpo es un anticuerpo M1 o el péptido/la proteína de unión a Ca2+ es un péptido de la proteína C y el anticuerpo es un anticuerpo HPC4.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ligando de analito está marcado y también tras la adición del tampón de separación permanece marcado con un marcador para la detección del analito.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la detección del analito marcado tiene lugar mediante un inmunoensayo utilizando la tecnología TRACE.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la detección del analito marcado tiene lugar por medio de inmunocromatografía.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la muestra biológica se utiliza sin diluir y en un volumen tal, que la parte recubierta de la fase sólida se pone completamente en contacto con la muestra biológica.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la duración de la adición de la muestra hasta la detección no supera los 30 min. y el procedimiento se considera un procedimiento de prueba rápida.

13. Kit para la realización de un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende:

a) una fase sólida con una pareja de unión reversible inmovilizada 1,

b) un complejo que comprende un ligando de analito unido a la pareja de unión reversible 2, pudiendo encontrarse este complejo opcionalmente inmovilizado sobre la fase sólida ya mediante la unión de las parejas de unión reversible 1 y 2,

c) un tampón de separación, que rompe la unión entre las parejas de unión reversible 1 y 2, manteniéndose opcionalmente sin embargo la unión del analito al ligando de analito, y conteniendo el tampón de separación un componente marcado adicional necesario para la detección, que es un segundo ligando de analito para la realización de un inmunoensayo de tipo sándwich.

14. Kit según la reivindicación 13, en el que el ligando de analito es un anticuerpo anti-PCT.

15. Kit según la reivindicación 13 ó 14, en el que el par de unión de parejas de unión reversible 1 y 2 se selecciona de entre uno de los siguientes pares de unión: a) oligómeros peptídicos cargados positiva y negativamente, b) péptido/proteína de unión a Ca2+ y anticuerpo, que se une al péptido/la proteína con mayor afinidad cuando el péptido/la proteína se ha unido al Ca2+,

c) oligohistidina (por ejemplo 6His) y Ni-NTA, d) biotina y avidina o estreptavidina o neutravidina.