PROCEDIMIENTO PARA ACTIVAR LA PRETROMBINA 1.

Un procedimiento para convertir la pretrombina 1 en trombina, que comprende:

proporcionar pretrombina 1 a una concentración de 0,1 mg/ml a 10 mg/ml en una solución acuosa de NaCl de 30 mM a 110 mM a pH 6,4-8.0; proporcionar oscutarina C inmovilizada en un soporte sólido; y aplicar la solución acuosa a la oscutarina C inmovilizada para proporcionar de 500 mg a 4000 mg de pretrombina 1 por ml del soporte sólido y un tiempo de contacto entre la pretrombina 1 y la oscutarina C de 1,8 a 3,5 minutos ambos inclusive, por lo que la pretrombina 1 se escinde para producir trombina, y se obtiene una solución que contiene trombina

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2006/049076.

Solicitante: ZYMOGENETICS, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 1201 EASTLAKE AVENUE EAST SEATTLE, WA 98102 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: STENLAND,CHRISTOPHER,J, DE JONGH,KAREN,S, MALLET,Robert,W, BOONE,Jonathon,C, FORSTROM,John,W.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 21 de Diciembre de 2006.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N9/74 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Trombina.

Clasificación PCT:

  • C12N9/00 C12N […] › Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2371208_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

La penúltima etapa de la cascada de la coagulación es la conversión catalizada por complejo de Factor Xa del zimógeno protrombina en la enzima activa trombina. La protrombina es una glicoproteína dependiente de vitamina K de cadena sencilla que se sintetiza en el hígado. Contiene un dominio gla, dos regiones kringle, una cadena A y un dominio de serina proteasa (cadena B). La conversión en trombina requiere que la protrombina se escinda en dos sitios, eliminando el dominio gla y las regiones kringle, escindiendo entre las cadenas A y B para producir la proteasa activa, denominada trombina . La trombina se usa terapéuticamente para promover la hemostasia en la cirugía y como componente de adhesivos y selladores tisulares. Las trombinas humana y bovina, ambas derivadas de plasma, están actualmente autorizadas para su uso terapéutico. Sería ventajoso obtener la trombina a partir de una fuente recombinante para evitar el potencial de contaminación que es intrínseco a los productos derivados de plasma. La trombina bovina se ha asociado con anomalías hemostáticas que son el resultado de la inmunogenicidad de la propia trombina bovina y/o proteínas contaminantes (Ortel y col., Ann. Surg. 233(1): 88-96, 2001; Lawson y col., Ann. Thorac. Surg. 79(3): 1037-1038, 2005) y lleva un aviso de "recuadro negro" que advierte del uso repetido en pacientes que han desarrollado anticuerpos contra la trombina bovina. Sin embargo, la producción de protrombina recombinante ha demostrado ser problemática y los rendimientos han continuado siendo reducidos. Como alternativa a la purificación a partir de plasma, la trombina puede prepararse a partir de una pretrombina recombinante (por ejemplo, pretrombina 1), como se desvela en la Patente de Estados Unidos Nº 5.476.777. La pretrombina 1 es un precursor de trombina inactivo que no contiene el dominio gla o la primera región kringle de la protrombina, que puede producirse por expresión de un ADN de protrombina truncado en células recombinantes. La trombina activa se produce a partir de la pretrombina 1 por tratamiento con cualquiera de varias proteasas activantes, incluyendo activadores de la protrombina obtenidos de veneno de serpiente. Véase, por ejemplo, Speijer y col., J. Biol. Chem. 261: 13258-13267, 1986; Masci y col., Biochemistry International 17: 825-835, 1988; y Morita y col., Meth. Enzym. 80: 303-311, 1980. La activación de pretrombina 1 en trombina se complica por la actividad proteolítica de la trombina sobre la pretrombina. Esta actividad, que puede reducir el rendimiento global de la trombina , puede aumentarse por las condiciones necesarias para estabilizar la proteína. Continúa existiendo la necesidad en la técnica de procedimientos para activar eficazmente la pretrombina 1 en trombina . Descripción de la invención La presente invención proporciona procedimientos para convertir la pretrombina 1 en trombina. Los procedimientos de la invención comprenden las etapas de (a) proporcionar la pretrombina 1 a una concentración de 0,1 mg/ml a 10 mg/ml en una solución acuosa de NaCl de 30 mM a 110 mM a pH 6,4-8,0, (b) proporcionar la oscutarina C inmovilizada en un soporte sólido, y (c) aplicar la solución acuosa a la oscutarina C inmovilizada para proporcionar de 500 mg a 4000 mg de pretrombina 1 por ml del soporte sólido y un tiempo de contacto entre la pretrombina 1 y la oscutarina C de 1,8 a 3,5 minutos, ambos inclusive, por lo que la pretrombina 1 se escinde para producir trombina, y se obtiene una solución que contiene trombina. Dentro de una realización de la invención, la solución acuosa de pretrombina 1 está a pH = 7,4. Dentro de otra realización de la invención, la pretrombina 1 es pretrombina 1 humana. Dentro de realizaciones adicionales de la invención, la oscutarina C está inmovilizada en el soporte sólido a una concentración de 0,1 a 20 mg de oscutarina C por ml de soporte. Dentro de realizaciones relacionadas, la oscutarina C está inmovilizada en el soporte sólido a una concentración de 0,1 a 5,0 mg de oscutarina C por ml de soporte. Dentro de otra realización de la invención, el soporte sólido comprende una matriz de agarosa reticulada. Dentro de una realización adicional, la concentración de NaCl en la solución acuosa de pretrombina 1 es de 70 mM. Dentro de otras realizaciones, los procedimientos de la invención se llevan a cabo a una temperatura de 17ºC a 45ºC, una temperatura de 20ºC a 37ºC, una temperatura de 20ºC a 30ºC, o una temperatura de 25ºC. Dentro de ciertas realizaciones de la invención, los procedimientos comprenden además las etapas de (d) aplicar la solución que contiene trombina a un medio de captura seleccionado del grupo que consiste en un medio de cromatografía de intercambio iónico y un medio de cromatografía de afinidad, por lo que la trombina está unida al medio de captura, (e) lavar la trombina unida, y (f) recuperar la trombina unida del medio de captura. Dentro de ciertas realizaciones, el medio de captura es un medio de cromatografía de afinidad, tal como un medio que comprende para-aminobenzamidina (PABA) inmovilizada en un soporte sólido. Dentro de una realización relacionada, el medio de captura comprende PABA inmovilizada, y la etapa de recuperación comprende lavar la PABA inmovilizada con NaCl e isopropanol a concentraciones suficientes para eluir la trombina unida. Estos y otros aspectos de la invención se harán evidentes al hacerse referencia a la descripción detallada de la invención y los dibujos adjuntos siguientes. En los dibujos: 2 E06846013 18-10-2011   La Fig. 1 ilustra los efectos sobre la eficacia de activación de tiempo de contacto con activador y concentración de pretrombina 1 variables. La Fig. 2 muestra los índices de conversión de pretrombina 1 (PT-1) y pretrombina 2 (PT-2) en trombina en función del caudal a través de la columna de activador. Las Figs. 3, 4 y 5 ilustran los efectos del pH sobre la activación de pretrombina 1 en trombina. Las Figs. 6, 7 y 8 ilustran los efectos de la concentración de NaCl de la activación de pretrombina 1 en trombina. La Fig. 9 ilustra el efecto de la temperatura sobre la conversión de PT-1 y PT-2 en trombina. La Fig. 10 muestra las cantidades relativas de trombina, PT-1 y PT-2 en un procesamiento de activación usando una carga de PT-1 de 4,0 mg/ml y un tiempo de contacto de 2,5 minutos. Como se usa en el presente documento, el término "trombina" denota la enzima activada, también conocida como trombina , que se obtiene como resultado de la escisión proteolítica de la protrombina (factor II). El término "trombina" se usa en el presente documento para denotar esta proteína independientemente de su origen. La trombina humana es una proteína de 295 aminoácidos compuesta por dos cadenas polipeptídicas unidas por un enlace disulfuro. Pueden usarse dentro de la presente invención trombinas tanto humanas como no humanas. La trombina se usa médicamente como agente hemostático y como componente de adhesivos tisulares. La "pretrombina 1" es una proteína que se obtiene como resultado de la eliminación de los dominios gla y primer dominio kringle (en su conjunto denominados fragmento de protrombina 1) de la protrombina. La pretrombina 1 puede producirse por escisión de la protrombina con trombina o directamente por producción recombinante. La pretrombina 1 puede activarse en trombina mediante una escisión proteolítica adicional. Los intervalos numéricos enumerados en el presente documento incluyen sus puntos finales. Todas las referencias citadas en el presente documento se incorporan por referencia en su totalidad. La presente invención proporciona procedimientos para la activación del precursor de trombina pretrombina 1 (PT-1) en la enzima activa trombina. Aunque, con fines ilustrativos, la invención se describe en los términos de la PT-1 humana recombinante, la invención también incluye la activación de formas no humanas y no recombinantes de la pretrombina 1. Por lo tanto, la invención incluye, sin limitación, procedimientos para activar la PT-1 derivada de plasma humana y no humana (por ejemplo, bovina) y la PT-1 recombinante. Dentro de la presente invención, la activación de pretrombina 1 (PT-1) en trombina se consigue enzimáticamente por hidrólisis de la cadena principal polipeptídica de PT-1 en dos sitios específicos. La enzima usada para catalizar esta conversión se obtiene del veneno de la serpiente taipán de la costa (Oxyuranus scutellatus). Una serina proteasa compleja (Oscutarina C) purificada a partir del veneno bruto es capaz de mimetizar las funciones de los Factores Va y Xa que son necesarios para la activación de la protrombina en trombina in situ. Dentro de una realización de la invención, la trombina activada se captura por cromatografía de afinidad pasando el eluyente que contiene trombina de la columna de activador sobre una columna de para-aminobenzidina (PABA)... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para convertir la pretrombina 1 en trombina, que comprende: proporcionar pretrombina 1 a una concentración de 0,1 mg/ml a 10 mg/ml en una solución acuosa de NaCl de 30 mM a 110 mM a pH 6,4-8.0; proporcionar oscutarina C inmovilizada en un soporte sólido; y aplicar la solución acuosa a la oscutarina C inmovilizada para proporcionar de 500 mg a 4000 mg de pretrombina 1 por ml del soporte sólido y un tiempo de contacto entre la pretrombina 1 y la oscutarina C de 1,8 a 3,5 minutos ambos inclusive, por lo que la pretrombina 1 se escinde para producir trombina, y se obtiene una solución que contiene trombina. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además: aplicar la solución que contiene trombina a un medio de captura seleccionado del grupo que consiste en un medio de cromatografía de intercambio iónico y un medio de cromatografía de afinidad, por lo que la trombina se une al medio de captura; lavar la trombina unida; y recuperar la trombina unida del medio de captura. 3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el medio de captura es un medio de cromatografía de afinidad. 4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el medio de cromatografía de afinidad comprende PABA inmovilizada en un soporte sólido. 5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la oscutarina C se inmoviliza en una matriz de agarosa reticulada. 6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la concentración de oscutarina C en la matriz es de 1,0 mg/ml. 7. El procedimiento de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que la solución acuosa de pretrombina 1 es a pH = 7,4. 8. El procedimiento de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que la pretrombina 1 es pretrombina 1 humana. 9. El procedimiento de la reivindicación 1, que se lleva a cabo a una temperatura de 17ºC a 45ºC, preferentemente de 20ºC a 37ºC, y más preferentemente de 20ºC a 30ºC. 10. El procedimiento de la reivindicación 9, que se lleva a cabo a una temperatura de 25ºC. 11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la oscutarina C se inmoviliza en el soporte sólido a una concentración de 0,1 a 20 mg de oscutarina C por ml de soporte. 12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la concentración es de 0,1 a 5,0 mg de oscutarina C por ml de soporte. 13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la concentración de NaCl en la solución acuosa de pretrombina 1 es de 70 mM. 14. Un procedimiento para convertir la pretrombina 1 en trombina, que comprende: proporcionar pretrombina 1 a una concentración de 1,0 mg/ml a 10 mg/ml en una solución acuosa de NaCl de 30 mM a 110 mM a pH = 6,8-8,0, proporcionar oscutarina C inmovilizada en un soporte sólido a una concentración de 0,1 mg a 20 mg de oscutarina C por ml de soporte; aplicar la pretrombina 1 a la oscutarina C inmovilizada para proporcionar una proporción de pretrombina 1:oscutarina C de 500 mg a 4000 mg de pretrombina 1 por ml del soporte sólido y un tiempo de contacto entre la pretrombina 1 y la oscutarina C de 1,8 a 3,5 minutos a una temperatura de 20ºC-30ºC, por lo que la pretrombina 1 se escinde para producir trombina, y se obtiene una solución que contiene trombina; aplicar la solución que contiene trombina a PABA inmovilizada, por lo que la trombina se une a la PABA; lavar la trombina unida para eliminar impurezas; y recuperar la trombina unida de la PABA inmovilizada. 15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la etapa de recuperación comprende lavar la PABA inmovilizada con NaCl e isopropanol a concentraciones suficientes para eluir la trombina unida. 8 E06846013 18-10-2011   9 E06846013 18-10-2011   E06846013 18-10-2011   11 E06846013 18-10-2011   12 E06846013 18-10-2011   13 E06846013 18-10-2011   14 E06846013 18-10-2011   E06846013 18-10-2011   16 E06846013 18-10-2011   17 E06846013 18-10-2011   18 E06846013 18-10-2011

 

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