PROCEDIMIENTO OPTIMIZADO PARA LA OBTENCIÓN DE PÉPTIDOS INHIBIDORES DE LA ACTIVIDAD DE LA ECA A PARTIR DE SUERO LÁCTEO, PÉPTIDOS INHIBIDORES DE LA ECA Y ALIMENTO QUE LOS COMPRENDE.

Procedimiento optimizado para la obtención de péptidos inhibidores de la actividad de la ECA (enzima convertidora de angiotensina) a partir de suero lácteo, péptidos inhibidores de la ECA y alimento que los comprende. 5 Campo de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento optimizado para obtener péptidos que inhiben la actividad de la enzima convertidora de angiontensina (ECA) a partir de suero lácteo, péptidos inhibidores de la ECA y un alimento funcional que comprende dichos péptidos. 10 Los objetos anteriores se incluyen dentro del sector alimentario, en especial, en el campo de la industria láctea. Antecedentes de la invención Existen numerosos procedimientos descritos en la bibliografía para la liberación de péptidos bioactivos a partir de las proteínas lácteas. Algunos de ellos se basan en la 15 fermentación de esos materiales y otros, los más, en la hidrólisis enzimática con proteasas tanto de origen animal (pepsina, tripsina y quimotripsina) como vegetal (papaína y la bromelaína) o microbiano (proteinasa K o la termolisina) . Las ventajas de estos últimos procedimientos se relacionan con las condiciones de reacción más suaves en las que transcurren (Otte et aL, 1997, "Hydrolysis of bovine ¡3-lactoglobulin by various proteases and 20 identification of selected peptides". International Dair y Journal, 7: 835-848) y con la distinta especificidad por los residuos implicados en el enlace peptídico que facilitan el aislamiento y caracterización de los péptidos generados. Por el contrario, el principal inconveniente de la hidrólisis enzimática es que con frecuencia conduce a la producción de un intenso sabor amargo, debido a la presencia de residuos aminoacídicos hidrófobos en el péptido obtenido. 25 De las proteínas lácteas, las caseinas son muy susceptibles a la hidrólisis debido a su estructura abierta y flexible. Por este motivo están descritos un gran número y variedad de péptidos antihipertensivos de este origen (Yamamoto et aL, 1999, "Antihypertensive peptides derived from milk proteins". Nahrung-Food, 43 (3) : 159-164) . Por el contrario, la generación de actividad antihipertensiva a partir de las proteínas del suero lácteo dependen en mayor 30 medida de la proteasa utilizada y de las condiciones de hidrólisis. Las proteasas digestivas más utilizadas son la tripsina, la pepsina y la quimotripsina. La tripsina se ha empleado con éxito en la producción de péptidos inhibidores de la ECA a partir proteínas séricas. Esto puede deberse a la especificidad que presenta la ECA por sustratos o inhibidores competitivos con Lys o Arg en el extremo C-terminal (López-Fandiño 35 et aL, 2006, "Physiological, chemical and technological aspects of milk-protein-derived peptides with antihypertensive and ACE-inhibitor y activity". International Dair y Journal, 16: 1277-1293) . La [3-Lg bovina contiene muchos enlaces susceptibles teóricamente a la pepsina. Sin embargo, es resistente a la acción de dicha enzima (Reddy et aL, 1988, "Structural and conformational basis of the resistance of [3-lactoglobulin to peptic and chymotr y ptic digestion". Journal of Agricultural and Food Chemistr y , 36 (4) : 737-741) , debido 5 a la estructura compacta de la proteína que oculta los aminoácidos hidrofóbicos susceptibles a la hidrólisis (Brownlow et aL, 1997, "Bovine 13-lactoglobulin at 1.8 Á resolution -still an enigmatic lipocalin". Structure, 5 (4) : 481-495) . La desnaturalización térmica parcial de la 13-Lg supone la aparición de enlaces susceptibles a la pepsina. Por el contrario, la a-La es sensible a la acción de la pepsina (Schmidt y van Marwijk, 1993, "Enzymatic hydrolysis of 10 whey proteins. Influence of heat treatment of a-Iactalbumin and [3-lactoglobulin on their proteolysis by pepsin and papain". Neth. Milk Dair y J., 47: 15-22) , pero se requieren tiempos superiores a las tres horas para que se produzca la liberación de péptidos inhibidores de la ECA (Pihlanto-Leppala et aL, 2000, "Angiotensin-I-converting enzyme inhibitor y properties of whey protein digests: concentration and characterization of active peptides". J. Dair y 15 Res., 67: 53-64) . Finalmente, la quimotripsina hidro liza rápidamente la a-La, y más lentamente la [3-Lg se hidroliza (Schmidt y Poli, 1991, "Enzymatic hydrolysis of whey proteins. Hydrolysis of a-Iactalbumin and [3-lactoglobulin in buffer solutions by proteolytic enzymes". Neth. Milk Dair y J., 45, 225-240) . La combinación de las tres enzimas digestivas, pepsina, tripsina y quimotripsina ha permitido la liberación de péptidos de pequeño tamaño y 20 con actividad inhibitoria de la ECA (Pihlanto-Leppala et aL, 2000, idem) . La principal ventaja del uso de enzimas digestivas para obtener péptidos antihipertensivos es que simula las condiciones fisiológicas del organismo en la liberación de péptidos con actividad biológica. La principal desventaja es que la menor disponibilidad y alto precio de estas enzimas, comparadas con las de origen microbiano. 25 Las enzimas microbianas más utilizadas para la hidrólisis de las proteínas de suero son la proteinasa K y la termolisina. Los hidrolizados obtenidos tras la acción de estas enzimas sobre concentrados de proteínas de suero presentan porcentajes de inhibición de la ECA superiores al 95% (Saito et aL, 1997, "Development of a new type of fermented cheese whey beverage with inhibitor y effects against angiotensin-converting 30 enzyme". Tohoku Journal of Agricultural Research, 48, 15-23) . Por ejemplo, hidrolizados con termolisina y proteinasa K poseían una potente actividad inhibitoria de la ECA (Hernández-Ledesma et aL, 2002, "Preparation of ovine and caprine [3-lactoglobulin hydrolysates with ACE-inhibitor y activity. Identification of active peptides from caprine [3-lactoglobulin hydrolysed with thermolysin". International Dair y Journal, 12 (10) : 805-812; 2006, "Effect of 35 b-Iactoglobulin hydrolysis with thermolysin under denaturing temperatures on the release of bioactive peptides". Journal of Chromatography A, 1116: 31-37, y Abubakar et al., 1998, "Structural analysis of new antihypertensive peptides derived from cheese whey protein by proteinase K digestion". J. Dair y Sci., 81, 3131-3138) . En cualquier caso nunca se han realizado experiencias con mezclas de enzimas microbianas con este fin. 5 En la tabla 1 se muestran algunos de los péptidos inhibidores de la ECA identificados en hidrolizados de suero lácteo con distintas enzimas y los correspondientes valores de IC50. Tabla 1: Péptidos inhibidores de la ECA obtenidos por hidrólisis enzimática de proteínas séricas. Péptido Secuencia Enzima IC50 Referencia (~M) ¡3-Lg f (78-80) IPA Proteinasa k 141 Abubakar el al., (1998) ¡3-Lg f (81-83) VFK Tripsina 1029 Pihlanto-Leppala el al. (2000) ¡3-Lg f (22-25) LAMA Tripsina 556 Pihlanto-Leppala el al. (2000) I3-Lg (f 142-ALPMHIR Tripsina 42, 6 Mullally el al. (1997) 148) ¡3-Lg f (32-40) LDAQSAPL Tripsina 635 Pihlanto-Leppala el R al. (2000) I3-Lg f (1 03-1 05) LLF Termolisina 79, 8 Hernández-Ledesma el al. (2002) I3-Lg f (58-61) LKQW Termolisina 34, 7 Hernández-Ledesma el al. (2002) ¡3-Lg f (94-1 00) VLDTDYK Pepsina, tripsina, 946 Pihlanto-Leppala el al. quimotripsina (2000) ¡3-Lg f (1 06-111) CMENSA Pepsina, tripsina, 788 Pihlanto-Leppala el al. quimotripsina (2000) ¡3-Lg f (15-19) VAGT Pepsina, tripsina, 1054 Pihlanto-Leppala el al. quimotripsina (2000) ¡3-Lg f (142-146) ALPMH Pepsina, tripsina, 521 Pihlanto-Leppala el al. quimotripsina (2000) ¡3-Lg (f 102-YLLF Pepsina, tripsina, 172 Mullally el al. (1997) 105) quimotripsina ¡3-Lg (f 46-53) LKPTPEGN Termolisina >270 Hernández-Ledesma O el al. (2002) ¡3-Lg (f 122-LVRT Termolisina 2470 Hernández-Ledesma 125) et al. (2002) a-La f (50-53) YGLF Pepsina 733 Mullally el al. (1997) a-La f (50-52) YGL Pepsina, tripsina, 409 Pihlanto-Leppala el quimotripsina al. (2000) a-La f (104-108) WLAHK Tripsina 77 Pihlanto-Leppala el al. (2000) a-La f (99-1 08) VGINYWLA Tripsina HK BSA f (221-222) FP Proteinasa k BSA f (208-216) ALKAWSVA Tripsina R 327 315 3 Pihlanto-Leppala el al. (2000) Abubakar et al. (1998) Chiba y Yoshikawa (1991 ) A pesar de la amplia investigación que se ha realizado para la obtención de péptidos antihipertensivos a partir de proteínas de suero de leche, hasta la fecha los procesos diseñados han sido escasamente optimizados tanto en términos del consumo de enzima 5 como de la búsqueda de mezclas de proteasas que permitan reducir la concentración necesaria de enzimas en la mezcla para obtener peptidos con valores de IC50 adecuados. La invención que se propone consiste precisamente en el diseño de un procedimiento que, mediante la adecuada selección y proporción de dos proteasas de acción y especificidad complementaria, permite reducir la concentración de enzimas 10 necesarias para lograr un hidrolizado que proporcione un determinado valor de IC50 y porcentaje de inhibición.... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento optimizado para obtener péptidos inhibidores de la actividad de la ECA, enzima convertidora de angiontensina, en el que están presentes las etapas de ultrafiltración de suero lácteo para obtener un concentrado de suero, hidrólisis enzimática, ultrafiltración de hidrolizados y separación de los péptidos inhibidores, se caracteriza por 5 comprender: una selección y adición de una mezcla de dos proteasas de origen microbiano y acción complementaria a dicho concentrado de suero, para la hidrólisis de éste, en la que dicha proporción de enzima/sustrato oscila entre 0, 5 y 3 unidades enzimáticas/mg de proteína de suero, con el fin de obtener péptidos con un porcentaje de inhibición de la ECA 10 superior al 70% y un índice IC50 de 30 a 100 µg/ml. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que la mezcla de proteasas se selecciona entre una de las siguientes combinaciones: termolisina-proteinasa k, termolisina-neutrasa y alcalasa-termolisina, para las cuales la proporción de cada una de las proteasas en la mezcla oscila entre 15 y 85%. 15 3. Péptidos inhibidores de la ECA que se obtienen mediante el procedimiento definido según las reivindicaciones 1 y 2. 4. Péptidos inhibidores de la ECA según la reivindicación 3, caracterizados por que presentan un índice IC50 situado entre 30 y 100 µg/ml y porcentajes de inhibición de la ECA superiores al 70%. 20 5. Péptidos inhibidores de la ECA según las reivindicaciones 3 y 4, caracterizados por que se emplean en la fabricación de alimentos funcionales. 6. Alimento funcional que comprende péptidos inhibidores de la ECA, según la reivindicación 3.