PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS FUNCIONALIZADAS CON MOLÉCULAS ORGÁNICAS FLUORESCENTES.

Procedimiento de obtención de nanopartículas metálicas funcionalizadas con moléculas orgánicas fluorescentes.



La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de nanopartículas metálicas funcionalizadas con moléculas orgánicas fluorescentes mediante el tratamiento de una o más sales metálicas con un agente reductor en presencia de una molécula orgánica fluorescente. La invención se refiere también a las nanopartículas metálicas obtenibles por dicho procedimiento y a su uso para la detección de moléculas y analitos.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201130447.

Solicitante: UNIVERSIDAD PABLO DE OLAVIDE.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: MEJIAS ROMERO,JOSE ANTONIO, ZADERENKO PARTIDA,ANA PAULA, CARO SALAZAR,CARLOS, SAYAGUÉS DE VEGA,María Jesús.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • B22F9/16 TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES.B22 FUNDICION; METALURGIA DE POLVOS METALICOS.B22F TRABAJO DE POLVOS METALICOS; FABRICACION DE OBJETOS A PARTIR DE POLVOS METALICOS; FABRICACION DE POLVOS METALICOS (fabricación de aleaciones mediante metalurgia de polvos C22C ); APARATOS O DISPOSITIVOS ESPECIALMENTE ADAPTADOS PARA POLVOS METALICOS. › B22F 9/00 Fabricación de polvos metálicos o de sus suspensiones; Aparatos o dispositivos especialmente adaptados para ello. › por procedimientos químicos.
  • B82Y40/00 B […] › B82 NANOTECNOLOGIA.B82Y USOS O APLICACIONES ESPECIFICOS DE NANOESTRUCTURAS; MEDIDA O ANALISIS DE NANOESTRUCTURAS; FABRICACION O TRATAMIENTO DE NANOESTRUCTURAS.Fabricación o tratamiento de nanoestructuras.
  • C09K11/06 QUIMICA; METALURGIA.C09 COLORANTES; PINTURAS; PULIMENTOS; RESINAS NATURALES; ADHESIVOS; COMPOSICIONES NO PREVISTAS EN OTRO LUGAR; APLICACIONES DE LOS MATERIALES NO PREVISTAS EN OTRO LUGAR.C09K SUSTANCIAS PARA APLICACIONES NO PREVISTAS EN OTRO LUGAR; APLICACIONES DE SUSTANCIAS NO PREVISTAS EN OTRO LUGAR.C09K 11/00 Sustancias luminiscentes, p. ej. electroluminiscentes, quimiluminiscentes. › que contienen sustancias orgánicas luminiscentes.
  • G01N33/52 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Utilización de compuestos o de composiciones para investigaciones colorimétricas, espectrofotométricas o fluorométricas, p. ej. utilización de cintas de papel indicador.

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Fragmento de la descripción:

PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS

FUNCIONALIZADAS CON MOLÉCULAS ORGÁNICAS FLUORESCENTES

CAMPO DE LA TÉCNICA

La presente invención se refiere a s fluorescentes, a un método para la preparación de las mismas y a sus usos.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La detección mediante técnicas de fluorescencia constituye la base de la mayoría

de los ensayos biológicos actualmente disponibles. No obstante, la detección fluorescente a nivel molecular presenta serias limitaciones derivadas del uso de fluoróforos orgánicos, tales como una baja relación señal/ruido, la baja fotoestabilidad de los fluoróforos y su elevada fotointermitencia (en inglés “photoblinking”) . A lo largo de la última década se está realizando un gran esfuerzo por encontrar

alternativas a la utilización de moléculas orgánicas fluorescentes, que ofrezcan una solución aceptable a las limitaciones que presentan estas moléculas. En este sentido, las nanopartículas semiconductoras o puntos cuánticos (en inglés “Quantum Dots” (QD) ) , poseen rendimientos cuánticos similares a los de los fluoróforos orgánicos pero mayores coeficientes de extinción y mayor fotoestabilidad [Gao, X.; Yang, L.; Petros, J.A., Curr.

Opin. Biotechnol. 2005, 16, 63–72]. Aunque los QD son muy prometedores en aplicaciones biológicas [Fernandez-Arguelles, M.T.; Costa-Fernandez, J.M.; Pereiro, R.; Sanz-Medel, A., Analyst. 2008, 133, 444-447; Xue, X.; Pan, J.; Xie, H.; Wang, J.; Zhang, S., Talanta 2009, 77, 1808-1813; Ishihama, Y.; Funatsu, T., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009, 381, 33–38; Yong, K.T.; Roy, I.; Ding, H.; Bergey, E.J.; Prasad,

P.N., Small. 2009, 5, 1997–2004; Bentolila, L.A.; Ebenstein, Y.; Weiss, S. J., Nucl. Med. 2009, 50, 493–496; Gill, R.; Zayats, M.; Willner, I., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2008, 47, 7602–7625], presentan también serias desventajas debidas a sus propiedades superficiales, tales como la necesidad de utilizar disolventes orgánicos en su síntesis, la complejidad de su síntesis, su baja estabilidad en agua, su difícil funcionalización o su

unión inespecífica a biomoléculas. Además de sus desfavorables propiedades superficiales, otro problema que presentan los QD en aplicaciones in vivo es su elevada toxicidad [Drummen, P.C., Int. J. Mol. Sci. 2010, 11, 154-163; Singh, N.; Manshian, B.; Jenkins, G.J.; Griffiths, S.M.; Williams, P.M.; Maffeis, T.G.; Wright, C.J.; Doak, S.H.,

Biomaterials. 2009, 30, 3891–3914; Lewinski, N.; Colvin, V.; Drezek, R. Small. 2008, 4, 26–49; Hsieh, M.S.; Shiao, N.H.; Chan, W.H. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 2122–2135; Roiter, Y.; Ornatska, M.; Rammohan, A.R.; Balakrishnan, J.; Heine, D.R.; Minko, S., Langmuir 2009, 25, 6287–6299; Chen, J.; Hessler, J.A.; Putchakayala, K.; Panama,

B.K.; Khan, D.P.; Hong, S.; Mullen, D.G.; Dimaggio, S.C.; Som, A.; Tew, G.N.; Lopatin, A.N.; Baker, J.R.; Holl, M.M.; Orr, B.G., J. Phys. Chem. B. 2009, 113, 11179– 11185]. Por otra parte, este tipo de nanopartículas no permite la detección mediante espectroscopias vibracionales amplificadas en superficie, quedando limitado su uso a la detección por fluorescencia.

Se sabe que las nanopartículas metálicas interaccionan con fluoróforos cercanos a su superficie afectando a la intensidad de su emisión, ya sea disminuyéndola o aumentándola. Cuando esta interacción conduce a un aumento de la fluorescencia, el efecto se conoce como Fluorescencia Amplificada por el Metal (“Metal Enhanced Fluorescence”, MEF) . El efecto MEF se puede explicar por la confluencia de dos

mecanismos, por un lado, el aumento de los campos electromagnéticos incidentes asociado a la nanopartícula metálica conduce a un aumento en la emisión del fluoróforo, de forma similar a lo que sucede en el efecto SERS (Espectroscopia Raman Amplificada en Superficie) . Por otra parte, la interacción del fluoróforo con el plasmón de superficie de las nanopartículas conduce a un aumento de las velocidades de

decaimiento, tanto radiativa como no radiativa, y, consecuentemente, al aumento del rendimiento cuántico y la disminución del tiempo de vida [Lakowicz, J.R.; Gr y czynski, I.; Malicka, J.; Gr y czynski, Z.; Geddes, C.D., J. Fluores. 2002, 12, 299-302; Lakowicz,

J. R., Analytical Biochem. 2005, 337, 171-194; Cade, N. I.; Ritman-Meer, T.; Kwakwa

K. A.; Richards, D., Nanotechnology 2009, 20, 285201-285206]. Adicionalmente, y

debido a la disminución del tiempo de vida, la fotoestabilidad del fluoróforo aumenta [Lakowicz, J.R.; Shen, Y.; D’Auria, S.; Malicka, J.; Fang, J.; Gr y czynski, Z.; Gr y czynski, I., Analytical Biochem. 2002, 301, 261-277; Lakowicz, J.R.; Malicka, J.; D’Auria, S.; Gr y czynski, I., Analytical Biochem. 2003, 320, 13-20; Lukomska, J.; Malicka, J.; Gr y czynski, I.; Lakowicz, J. R., J. Fluores. 2004, 14, 417-423]. Algunos de

los factores que afectan la obtención de efecto MEF son: la naturaleza del metal, la distancia nanopartícula-fluoróforo, el estado de agregación de las nanopartículas, y el solapamiento espectral existente entre el plasmón de superficie de las nanopartículas y la emisión del fluoróforo [Huang, T.; Murray, R.W., Langmuir 2002, 18, 7077–7081; Kühn, S.; Håkanson, U.; Rogobete, L.; Sandoghdar, V., Phys. Rev. Lett. 2006, 97, 17402-17405; Anger, P.; Bharadwaj, P.; Novotny, L., Phys. Rev. Lett. 2006, 96, 113002-113003; Zhang, J.; Malicka, J.; Gr y czynski, I.; Lakowicz, J. R., Analytical Biochem. 2004, 330, 81-86; Zhang, J.; Fu, Y.; Chowdhur y , M. H.; Lakowicz, J. R.,

Nano Lett. 2007, 7, 2101-2107; Chen, Y.; Munechika, K.; Ginger, D. S., Nano Lett. 2007, 7. 690-696].

La distancia entre el fluoróforo y la superficie de la nanopartícula resulta crítica. En este sentido, se ha descrito que la fluorescencia de un fluoróforo se desactiva cuando la distancia al metal es demasiado corta (Anger, P.; Bharadwaj, P.; Novotny, L., Phys.

Rev. Lett. 2006, 96, 113002-113003; Principles of nano-optics, L. Novotny, B. Hecht, Cambridge University Press., p. 346) . La distancia ideal nanopartícula-metal se encuentra en el rango de 4-10 nm, haciendo necesario el uso de espaciadores en la conjugación fluoróforo-nanopartícula para obtener esta distancia, lo que dificulta la funcionalización de las nanopartículas con el fluoróforo, ya que se requiere una síntesis

en varias etapas y la modificación química del fluoróforo. Existe, por tanto, la necesidad de disponer de nuevos agentes fluorescentes, estables en medio acuoso, biocompatibles, fácilmente funcionalizables con moléculas y biomoléculas de interés, y que se puedan utilizar en ensayos de detección mediante técnicas de fluorescencia, así como de procedimientos más sencillos que permitan

obtener dichos agentes fluorescentes.

OBJETO DE LA INVENCIÓN

El problema técnico al que se enfrenta la presente invención es la obtención de nanopartículas metálicas funcionalizadas con moléculas orgánicas fluorescentes, en las

que el fluoróforo no se desactive por la proximidad del metal, que sean estables en medio acuoso, susceptibles de ser funcionalizadas con otras moléculas de interés (por ejemplo anticuerpos para aplicaciones biomédicas) y biocompatibles. Además, estas nanopartículas preferiblemente deben poder ser detectadas por otras técnicas diferentes a la fluorescencia, en concreto UV-Vis, IR y Raman.

La presente invención establece un método sencillo de obtención, en una sola etapa, de nanopartículas metálicas con propiedades fluorescentes a partir de disoluciones de sales metálicas, tales como sales de plata, oro, cobre, aluminio, platino, cobalto y paladio, mediante tratamiento en medio acuoso con un agente reductor en presencia de una molécula orgánica fluorescente. La invención se dirige también a las nanopartículas metálicas obtenibles por dicho procedimiento y a su uso como biomarcadores.

A diferencia de los métodos habituales de síntesis, en la presente invención se

adiciona el fluoróforo al medio acuoso en el que se lleva a cabo la reducción. Según se ha comentado previamente, al no utilizar espaciadores para unir el... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

l. Procedimiento para la obtención de nanopartículas metálicas funcionalizadas con moléculas orgánicas fluorescentes que comprende tratar una o más sales metálicas

con un agente reductor capaz de reducir el catión de la sal metálica al estado metálico, en medio acuoso, caracterizado porque el tratamiento de la una o más sales metálicas con el agente reductor se realiza en presencia de una molécula orgánica fluorescente.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

(a) Preparar una disolución acuosa que comprende una o más sales metálicas y una molécula orgánica fluorescente,

(b) Mezclar el agente reductor capaz de reducir el catión de la sal metálica al

estado metálico, opcionalmente en forma de una disolución acuosa que comprende dicho agente reductor, a la disolución obtenida en la etapa (a) , y

(c) Opcionalmente recolectar las nanopartículas.

3. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado

2 O porque las sales metálicas se seleccionan del grupo que comprenden sales de plata, oro, cobre, aluminio, platino, cobalto y paladio.

4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado

porque el agente reductor es un hidruro, citrato, alcohol, polímero reductor, 25 hidracina, hidroxilamina o mezclas de los mismos.

5. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la molécula orgánica fluorescente se selecciona entre fluoresceína, rodamina, cumarina, azul de metileno, azul Cascade, amarillo Lucifer, boro-dipirrometano, y

3 O mezclas de los mismos.

6. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque se realiza a una temperatura entre Oy 100°C.

7. Un procedimiento según la reivindicación 6 caracterizado porque se realiza a una temperatura entre O y 30°C.

8. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado 5 porque la reducción se realiza en presencia de un polímero.

9. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8 caracterizado porque la disolución acuosa definida en la etapa (a) comprende un polímero.

10. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque las nanopartículas obtenidas se recubren posteriormente con un polímero.

11. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado

porque el polímero es un polímero biocompatible. 15

12. Un procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque el polímero biocompatible se selecciona de entre polivinilpirrolidona y polietilenglicol.

13. Nanopartículas metálicas funcionalizadas con moléculas orgánicas fluorescentes

2 O obtenibles mediante el procedimiento definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Uso de las nanopartículas de la reivindicación 13 para la detección de moléculas o

analitos mediante técnicas de fluorescencia o espectroscopias vibracionales 25 amplificadas en superficie.


 

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