La invención se basa en la utilización de genes biosintéticos de rebecamicina de Saccharothrix aerocolonigenes para la producción de indolocarbazoles en microorganismos relacionados (Streptomyces spp.

). El método comprende el aislamiento de un fragmento de ADN de Saccharothrix aerocolonigenes ATCC39243 que contiene la agrupación de genes biosintéticos de rebecamicina y la expresión de dichos genes en Streptomyces albus, consiguiendo la producción de rebecamicina y derivados. De aplicación en el campo farmaceútico

Campo de la invención

La invención se adscribe al campo farmacéutico y en concreto a compuestos con potencial aplicación en oncología, con estructura química de indolocarbazoles y que se obtienen por fermentación de microorganismos transformados.

Estado de la técnica

La rebecamicina (Figura 1, A) es un producto natural de la bacteria Saccharothrix aerocolonigenes ATCC39243, perteneciente al grupo de los actinomicetos (Bush et al. J. Antibiot. 40: 668-678, 1987). Los actinomicetos son bacterias Gram-positivas cuyo hábitat natural es el suelo y que poseen un gran interés industrial y biotecnológico, en particular el género Streptomyces, pues producen una gran parte de los compuestos bioactivos conocidos. Muchos de estos compuestos poseen aplicación farmacéutica debido a su actividad antitumoral, antibacteriana, antifúngica, antiparasitaria, inmunosupresora, etc. La rebecamicina presenta actividad antibacteriana frente a bacterias Gram-positivas tales como Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus y Streptococcus faecalis (Bush et al. J. Antibiot. 40: 668-678, 1987). Sin embargo, su mayor interés se centra en su actividad antitumoral, la cual ha sido demostrada in vivo frente a diversos tumores implantados en ratón, e in vitro frente a varias líneas celulares tumorales (Bush et al. J. Antibiot. 40: 668-678, 1987).). En estos momentos existen dos derivados de rebecamicina en ensayos clínicos para su futuro uso como agentes antineoplásicos (NB-506, NSC655649).

Desde el punto de vista de su estructura química, la rebecamicina pertenece a la familia de productos naturales de los indolocarbazoles. Desde su descubrimiento en 1977, se han descrito más de 60 productos naturales de dicha familia, la cual puede ser clasificada en tres grupos según contengan estructuras de tipo indolo[2,3a]pirrolo[3,4-c]carbazol (p.ej. rebecamicina), indolo[2,3-a]carbazol (p.ej. tjipanazoles), o bis-indolilmaleimida (p.ej. arciriarrubina). Debido a lo novedoso de estas estructuras y a la amplia variedad de actividades de sus miembros (antimicrobiana, antifúngica, inmunosupresora, antitumoral, etc.), este grupo de alcaloides ha atraído considerable interés. En particular, los indolopirrolocarbazoles constituyen una nueva clase de agentes antitumorales, que pueden clasificarse en dos subgrupos según su mecanismo de acción. Un subgrupo consiste en inhibidores de quinasas, especialmente quinasa C, e incluye la estaurosporina (Figura 1, B) y análogos. El segundo subgrupo consiste en agentes que dañan el ADN actuando sobre la topoisomerasa I ó II, pero no sobre quinasas, e incluye la rebecamicina (Figura 1, A) y análogos. Actualmente hay varios indolocarbazoles en ensayos clínicos en Estados Unidos, Japón y Europa, incluyendo tanto inhibidores de quinasas (UCN-01, CGP41251, CEP-751) como agentes que dañan el ADN (NB-506, NSC655649) (Akinaga et al. Anti-Cancer Drug Design 15: 43-52, 2000).

En nuestros días existe una gran necesidad de nuevos agentes antitumorales, con actividad mejorada, con menos efectos secundarios indeseables, y con mayor selectividad, en comparación con los fármacos actualmente en uso. Tradicionalmente, la industria farmacéutica ha desarrollado nuevos fármacos mediante dos vías fundamentales: (1) búsqueda de nuevos productos naturales, y (2) síntesis y/o modificación química de determinados compuestos. Estos métodos siguen siendo útiles, pero suelen requerir inversiones muy importantes de recursos (tiempo, dinero, energía), pues normalmente es necesario analizar miles de productos para encontrar un nuevo compuesto prometedor. El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante ha abierto un interesante campo de investigación para la generación de nuevos compuestos bioactivos mediante la manipulación de genes implicados en la biosíntesis de agentes antitumorales, principalmente de bacterias del grupo de los actinomicetos. Estas técnicas también pueden ser usadas para mejorar la producción de compuestos naturales ya conocidos, pues las cepas naturales suelen producir bajas concentraciones del metabolito de interés.

La mayoría de los indolocarbazoles de origen natural poseen, en su estructura química, dos componentes: el aglicón indolocarbazol, y uno o más azúcares unidos a él. El aglicón indolocarbazol se biosintetiza a partir de dos moléculas de triptófano, al menos en el caso de los indolopirrolocarbazoles. En el caso de la rebecamicina (Figura 1, A), el azúcar es 4-O-metil-p-D-glucosa. En el caso de la estaurosporina (Figura 1, B), el azúcar es un derivado de L-ramnosa. Recientemente se han descrito algunos genes implicados en la biosíntesis de la parte glucídica de estos dos indolocarbazoles:

(1) Una región del cromosoma de Streptomyces longisporoflavus DSM10189 implicada en la biosíntesis del azúcar de la estaurosporina. Dicha región de ADN era capaz de complementar una mutación que afectaba a la biosíntesis

del azúcar. No existe ninguna prueba conocida de que dicha región de ADN esté implicada en la biosíntesis del aglicón indolocarbazol (US6210935).

(2) El gen ngt que codifica la N-glucosiltransferasa de rebecamicina de Saccharothrix aerocolonigenes ATCC39243, responsable de la transferencia del azúcar al aglicón indolocarbazol (Ohuchi et al. J. Antibiot. 53: 393-403, 2000). Tampoco existen pruebas conocidas de que la región de ADN identificada esté implicada en la biosíntesis del aglicón indolocarbazol. La secuencia de ADN del gen ngt ha sido previamente usada para la bioconversión de aglicones indolocarbazoles en derivados D-glucosilados. El procedimiento consistía en añadir un determinado aglicón indolocarbazol (sintetizado químicamente, o aislado de una cepa productora) al medio de cultivo de una cepa de Streptomyces lividans que contenía un plásmido con el gen ngt, y aislar el producto glucosilado del cultivo (Ohuchi et al. J. Antibiot.

53: 393-403, 2000).

Con la excepción mencionada del gen ngt (Ohuchi et al. J. Antibiot. 53: 393-403, 2000), no se conoce descripción previa de la secuencia de nucleótidos a la que se refiere la presente invención. Además, no se conoce ninguna descripción previa de secuencias de nucleótidos que hayan sido implicadas en la biosíntesis de un aglicón indolocarbazol.

Es también conocido en el estado de la técnica (EP 0769555 A1) un gen que codifica la actividad glicosiltransferasa derivado de la cepa ATCC39243 de Saccharothrix aerocolonigenes, vectores recombinantes que tienen dicho gen, las células hospedadoras transformadas con dichos vectores, un proceso para preparar glicosiltransferasa mediante el cultivo de dicha célula hospedadora transformada y un proceso para la preparación de derivados glicosilados indolopirrolocarbazoles mediante el cultivo de dicha célula huésped transformada y el uso de derivados indolopirrolocarbazoles como compuestos de partida.

Breve descripción de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento basado en la utilización de genes biosintéticos de rebecamicina para la producción de indolocarbazoles que comprende las siguientes etapas:

(1) Aislamiento de la región del cromosoma de Saccharothrix aerocolonigenes que contiene (entre otros genes), el gen que codifica la N-glucosiltransferasa de rebecamicina.

(2) Transferencia de la capacidad de biosintetizar rebecamicina a un microorganismo del género Streptomyces, mediante la introducción en el mismo de dicha región cromosómica.

(3) Determinación y análisis de la secuencia nucleotídica del agrupamiento génico responsable de la biosíntesis de rebecamicina.

(4) Expresión de ciertos genes de dicho agrupamiento de genes en un organismo hospedador, para producir indolocarbazoles derivados de rebecamicina.

Las técnicas de Biología molecular empleadas en la presente invención se detallan en: Kieser et al. (Practical Streptomyces genetics. The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000) y Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE.UU, 1989).

Etapa 1. Aislamiento de la región del cromosoma de Saccharothrix aerocolonigenes que contiene (entre otros), el gen que codifica la Nglucosiltransferasa de rebecamicina.

Ejemplo 1. Construcción de una librería genómica del ADN de Saccharothrix aerocolonigenes ATCC39243.

Con el fin de obtener ADN genómico de Saccharothrix aerocolonigenes ATCC39243, se usó una suspensión densa de esporas de este organismo para inocular matraces Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 25 ml de medio TSB (caldo de soja tripticaseína, Oxoid), y se incubaron a 28ºC durante 48 horas....

1. Procedimiento de obtención de indolocarbazoles mediante la utilización de genes biosintéticos de rebecamicina que comprende las siguientes etapas:

(a) Aislar del genoma de un organismo productor de indolocarbazoles como Saccharothrix aerocolonigenes un fragmento de ADN, que comprende:

i. una secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO:1; o

ii. una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO:1; o

iii. una secuencia de nucleótidos degenerada respecto a SEQ ID NO:1;

(b) Insertar dicho fragmento de ADN en un vector apropiado para las células hospedadoras.

(c) Introducir dicho vector recombinante en las células hospedadoras, de manera que pueda ser mantenido de forma estable.

(d) Cultivar las células hospedadoras obtenidas en un medio de cultivo adecuado para la producción de indolocarbazoles.

2. Una molécula de ácido nucleico que comprende:

i. una secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO:1; o

ii. una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO:1; o

iii. una secuencia de nucleótidos degenerada respecto a SEQ ID NO:1; donde dicha secuencia codifica o es complementaria a una secuencia que codifica al menos un enzima biosintético de rebecamicina.

3. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2, que codifica uno

o más polipéptidos, o comprende uno o más elementos genéticos, que poseen una actividad funcional en la síntesis de una estructura de indolocarbazol o un precursor de un indolocarbazol.

4. Una molécula de ácido nucleico, según la reivindicación 3, donde dicha estructura de indolocarbazol es la rebecamicina, o un derivado de rebecamicina o un precursor de rebecamicina.

5. Una molécula de ácido nucleico, según la reivindicación 2donde dicha molécula comprende -una o más secuencias reguladoras, y/o elementos genéticos codificantes o no codificantes de un agrupamiento de genes de biosíntesis de un indolocarbazol.

6. Una molécula de ácido nucleico, según la reivindicación 2, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID Nos:2 a 19, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria o degenerada a dicha secuencia.

7. Un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, que posee actividad funcional en la síntesis de una estructura de tipo indolocarbazol o un precursor de un indolocarbazol.

8. Un polipéptido, según la reivindicación 7, que comprende una o más de las secuencias aminoacídicas descritas en una o más de las SEQ ID Nos:2 a 19, que posee actividad funcional en la síntesis de una estructura de tipo indolocarbazol.

9. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6.

10. Un vector, según la reivindicación 9, designado como cósmido 14E8 y depositado en la cepa de Escherichia coli ED8767/14E8 con el número de identificación CECT 5984.

11. Una célula hospedadora no-humana o un organismo transgénico microbiológico que comprende una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6.

12. Una célula hospedadora no-humana o un organismo transgénico microbiológico que comprende un vector, según cualquiera de las reivindicaciones9 o

10.

13. Células hospedadoras no-humanas, según las reivindicaciones 11 o 12, que consisten en una cepa pura de Streptomyces spp., o sus mutantes o sus derivados transformados.

14. Células hospedadoras no-humanas, según la reivindicación 13, que consisten en una cepa pura de Streptomyces albus, o sus mutantes o sus derivados transformados.

15. Células hospedadoras no-humanas, según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, que expresan resistencia a rebecamicina.

16. Células hospedadoras no-humanas, según cualquiera de las reivindicaciones11 a 14, que expresan resistencia a un indolocarbazol.

17. Uso de una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en la producción de indolocarbazoles, o derivados de indolocarbazoles o precursores de indolocarbazoles.

18. Uso de una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en la producción de rebecamicina, o derivados de rebecamicina

o precursores de rebecamicina.

19. Uso de una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, para aumentar la producción de un indolocarbazol.

20. Uso de una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, para la obtención de células hospedadoras no-humanas que expresen resistencia a un indolocarbazol.

21. Uso de una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en técnicas de PCR encaminadas al aislamiento de genes de biosíntesis de indolocarbazoles.

22. Uso de células hospedadoras no-humanas u organismos transgénicos microbiológicos, según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en la producción de indolocarbazoles, o derivados de indolocarbazoles o precursores de indolocarbazoles.

23. Uso de células hospedadoras no-humanas u organismos transgénicos microbiológicos, según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en la producción de rebecamicina, o derivados de rebecamicina o precursores de rebecamicina.