PROCEDIMIENTO MEJORADO PARA PURIFICAR TFPI Y ANALOGOS DE TFPI.

Procedimiento mejorado para purificar TFPI y análogos del TFPI La presente solicitud reivindica el beneficio de las solicitudes provisionales en trámite de Nº de serie 60/494.546 presentada el 13 de agosto de 2003, Nº de serie 60/509.277 presentada el 8 de octubre de 2003 y Nº de serie 60/512.199 presentada el 20 de octubre de 2003. Campo de la invención La invención se refiere a la producción del TFPI purificado. Antecedentes de la invención El inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) tiene una longitud de 276 aminoácidos y funciona como un inhibidor de la coagulación sanguínea mediada por el factor tisular. Véase Patente de EE.UU. 4.966.852. El extremo amino terminal del TFPI está cargado negativamente, y el extremo carboxi terminal está cargado positivamente. La proteína TFPI contiene tres dominios inhibidores enzimáticos de tipo Kunitz. El TFPI contiene 18 restos de cisteína y forma 9 puentes disulfuro cuando se pliega correctamente. La secuencia primaria contiene tres sitios de glicosilación de consenso unidos a N (Asn-X-Ser/Thr). Los restos de asparagina de los sitios de glicosilación están localizados en las posiciones 145, 195 y 256. El TFPI también se conoce como inhibidor de la coagulación asociado a lipoproteínas (LACI), inhibidor del factor tisular (TFI), e inhibidor de la vía extrínseca (EPI). Se ha propuesto el uso del TFPI para el tratamiento de diversas indicaciones, que incluyen la sepsis (Patente de EE.UU. 6.063.764 y documento WO 93/24143), la trombosis venosa profunda (Patente de EE.UU. 5.563.123, Patente de EE.UU. 5.589.359 y documento WO 96/04378), la isquemia (Patente de EE.UU. 5.885.781, Patente de EE.UU. 6.242.414 y documento WO 96/40224), la reestenosis (Patente de EE.UU. 5.824.644 y documento WO 96/01649), y el cáncer (documentos U.S. 5.902.582 y WO 97/09063). Se ha demostrado que una variante del TFPI, que difiere del TFPI por la adición de un resto de alanina en el extremo amino terminal (ala-TFPI), es eficaz en modelos animales para el tratamiento de la sepsis. Carr y col., Circ. Shock 44(3): 126-137, 1994. El documento WO 03/032904 describe el tratamiento de la neumonía a través de la administración del TFPI o un análogo del TFPI. En la técnica existe una necesidad continua del TFPI biológicamente activo, purificado y de los procedimientos para obtenerlo. Resumen de la invención ES 2 367 563 T3 La invención proporciona al menos las siguientes formas de realización. Una forma de realización de la invención proporciona una preparación purificada que comprende una pluralidad de moléculas del TFPI o análogos del TFPI. Menos del 12% de las moléculas del TFPI o análogos del TFPI son especies modificadas. Las especies modificadas incluyen una o más de las siguientes: una molécula del TFPI o análogo del TFPI oxidada, según se detecta por medio de cromatografía de fase inversa; una molécula del TFPI o análogo del TFPI carbamilada, según se detecta por medio de cromatografía de intercambio catiónico; una molécula del TFPI o análogo del TFPI desamidada, según se detecta por medio de la medición indirecta de ácido isoaspártico; una molécula del TFPI o análogo del TFPI que comprende un aducto de cisteína, según se determina por el análisis de aminoácidos; moléculas del TFPI o análogo del TFPI agregadas, según se detectan por medio de cromatografía de exclusión por tamaño; y una molécula del TFPI o análogo del TFPI mal plegada, según se detecta por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS en condiciones no desnaturalizantes. Otra forma de realización de la invención es una formulación farmacéutica que comprende una pluralidad de moléculas de ala-TFPI. Menos del 12% de las moléculas de ala-TFPI son especies modificadas. Las especies modificadas incluyen una o más de las siguientes: una molécula de ala-TFPI oxidada, según se detecta por medio de cromatografía de fase inversa; una molécula de ala-TFPI carbamilada, según se detecta por medio de cromatografía de intercambio catiónico; una molécula de ala-TFPI desamidada, según se detecta por medio de la medición indirecta de ácido isoaspártico; una molécula de ala-TFPI que comprende un aducto de cisteína, según se determina por el análisis de aminoácidos; moléculas de ala-TFPI agregadas, según se detecta por medio de cromatografía de exclusión por tamaño; y una molécula de ala-TFPI mal plegada, según se detecta por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS en condiciones no desnaturalizantes. Otra forma de forma de realización de la invención proporciona un procedimiento para producir TFPI o análogo del TFPI purificado. El procedimiento comprende las siguientes etapas: (1) expresar el TFPI o análogo del TFPI en una célula huésped de E. coli resistente a la rifampicina, (2) aislar los cuerpos de inclusión que contienen el TFPI o análogo del TFPI de células huésped de E. coli, (3) aislar el TFPI o análogo del TFPI de los cuerpos de inclusión para obtener TFPI o análogo del TFPI aislado, (4) replegar el TFPI o análogo del TFPI aislado para formar TFPI o análogo del TFPI replegado, (5) purificar el TFPI o análogo del TFPI replegado por cromatografía de flujo rápido en 2 SP-Sepharose en presencia de Mg ++ para formar una primera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado, (6) concentrar la primera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado para formar una primera preparación concentrada del TFPI o análogo del TFPI purificado, (7) purificar la primera preparación concentrada del TFPI o análogo del TFPI por cromatografía de alta resolución (HP, por su sigla en inglés) en Q-Sepharose para formar una segunda preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado, (8) purificar la segunda preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HIC con butilo para formar una tercera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado, (9) purificar la tercera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HP en SP-Sepharose para formar una cuarta preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado, y (10) concentrar la cuarta preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado para formar una segunda preparación concentrada de moléculas del TFPI o análogo del TFPI purificado, en la que menos del 12% de las moléculas del TFPI o análogo del TFPI son especies modificadas. El TFPI o análogo del TFPI está codificado en un plásmido que comprende los siguientes elementos: (a) un promotor de la transcripción; (b) un sitio de unión del ribosoma junto al promotor de la transcripción; (c) una secuencia de nucleótidos codificadora, que codifica el TFPI o el análogo del TFPI adyacente al sitio de unión al ribosoma; (d) un terminador de la transcripción adyacente a la secuencia de nucleótidos codificadora; (e) un replicón; (f) un gen de resistencia a los antibióticos; y (g) un gen que codifica una enzima que elimina la metionina del extremo N-terminal. Otra forma de forma de realización de la invención es un procedimiento para producir TFPI o análogo del TFPI purificado. El procedimiento comprende las siguientes etapas: (1) purificar el TFPI o análogo del TFPI replegado por cromatografía de flujo rápido en SP-Sepharose para formar una primera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificada, (2) concentrar la primera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado para formar una primera preparación concentrada del TFPI o análogo del TFPI purificado, (3) purificar la primera preparación concentrada del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HP en Q-Sepharose para formar una segunda preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado, (4) purificar la segunda preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HIC con butilo para formar una tercera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado, (5) purificar la tercera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HP en SP-Sepharose para formar una cuarta preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado, y (6) concentrar la cuarta preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado para formar una segunda preparación concentrada de moléculas del TFPI o análogo del TFPI purificadas, en la que aproximadamente menos del 12% de las moléculas del TFPI o análogos del TFPI son especies modificadas. En el presente documento también se da a conocer un procedimiento para expresar el TFPI o un análogo del TFPI que comprende cultivar una célula huésped de E. coli resistente a la rifampicina en un medio de fermentación. La célula huésped de E. coli comprende un plásmido que tiene los siguientes elementos: (a) un promotor de la transcripción, (b) un sitio de unión del ribosoma junto al promotor de la transcripción reclac, (c) una secuencia de nucleótidos codificadora, que codifica el TFPI o análogo del... [Seguir leyendo]

1. Una preparación purificada que comprende una pluralidad de moléculas del TPFI o análogos del TPFI, en la que menos del 12% de las moléculas del TPFI o análogo del TPFI son especies modificadas, en la que las especies modificadas incluyen una o más de las siguientes: una molécula del TFPI o análogo del TFPI oxidada, según se detecta por medio de cromatografía de fase inversa; una molécula del TFPI o análogo del TFPI carbamilada, según se detecta por medio de cromatografía de intercambio catiónico; una molécula del TFPI o análogo del TFPI desamidada, según se detecta por medio de la medición indirecta de ácido isoaspártico; una molécula del TFPI o análogo del TFPI que comprende un aducto de cisteína, según se determina por el análisis de aminoácidos; moléculas del TFPI o análogo del TFPI agregadas, según se detectan por medio de cromatografía de exclusión por tamaño; y una molécula del TFPI o análogo del TFPI mal plegada, según se detecta por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS en condiciones no desnaturalizantes. 2. La preparación purificada de la reivindicación 1, en la que menos del 9% de las moléculas del TPFI o análogo del TPFI están oxidadas. 3. La preparación purificada de la reivindicación 1, en la que menos del 3% de las moléculas del TPFI o análogo del TPFI están carbamiladas. 4. La preparación purificada de la reivindicación 1, en la que menos del 9% de las moléculas del TPFI o análogo del TPFI están desamidadas. 5. La preparación purificada de la reivindicación 1, en la que menos del 2% de las moléculas del TPFI o análogo del TPFI comprenden un aducto de cisteína. 6. La preparación purificada de la reivindicación 1, en la que menos del 3% de las moléculas del TPFI o análogo del TPFI están agregadas. 7. La preparación purificada de la reivindicación 1, en la que menos del 3% de las moléculas del TPFI o análogo del TPFI están mal plegadas. 8. La preparación purificada de la reivindicación 1, en la que los miembros de la pluralidad de moléculas del TPFI tienen la secuencia de aminoácidos que se muestra en ID SEC Nº 1. 9. La preparación purificada de la reivindicación 1, en la que las moléculas de análogo del TPFI son moléculas de ala-TPFI. 10. Una formulación farmacéutica que comprende: ES 2 367 563 T3 una pluralidad de moléculas de ala-TPFI, en la que menos del 12% de las moléculas de ala-TPFI son especies modificadas, en la que las especies modificadas incluyen una o más de las siguientes: una molécula de ala-TFPI oxidada, según se detecta por medio de cromatografía de fase inversa; una molécula de ala-TFPI carbamilada, según se detecta por medio de cromatografía de intercambio catiónico; una molécula de ala-TFPI desamidada, según se detecta por medio de la medición indirecta de ácido isoaspártico; una molécula de ala-TFPI que comprende un aducto de cisteína, según se determina por el análisis de aminoácidos; moléculas de ala-TFPI agregadas, según se detectan por medio de cromatografía de exclusión por tamaño; y una molécula de ala-TFPI mal plegada, según se detecta por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS en condiciones no desnaturalizantes, 41 en la que la formulación farmacéutica comprende citrato de sodio 20 mM, L-arginina 300 mM y metionina 5 mM, pH 5,5. 11. Un procedimiento para producir moléculas del TPFI o análogos del TPFI purificadas, que comprende las etapas de: (1) expresar el TFPI o análogo del TFPI en una célula huésped de E. coli resistente a la rifampicina, en la que el TFPI o análogo del TFPI está codificado en un plásmido que comprende los siguientes elementos: (a) un promotor de la transcripción; (b) un sitio de unión del ribosoma adyacente al promotor de la transcripción reclac; (c) una secuencia de nucleótidos codificadora, que codifica el TFPI o el análogo del TFPI adyacente al sitio de unión del ribosoma; (d) un terminador de la transcripción adyacente a la secuencia de nucleótidos codificadora; (e) un replicón; (f) un gen de resistencia a los antibióticos; y ES 2 367 563 T3 (g) un gen que codifica una enzima que elimina la metionina del extremo N-terminal. (2) aislar los cuerpos de inclusión que contienen el TFPI o análogo del TFPI de las células huésped de E. coli; (3) aislar el TFPI o análogo del TFPI de los cuerpos de inclusión para obtener el TFPI o análogo del TFPI aislado; (4) replegar el TFPI o análogo del TFPI aislado para formar el TFPI o análogo del TFPI replegado; (5) purificar el TFPI o análogo del TFPI replegado por cromatografía de flujo rápido en SP-Sepharose en presencia de Mg ++ para formar una primera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado; (6) concentrar la primera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado para formar una primera preparación concentrada del TFPI o análogo del TFPI purificado; (7) purificar la primera preparación concentrada del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HP en Q-Sepharose para formar una segunda preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado; (8) purificar la segunda preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HIC con butilo para formar una tercera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado; (9) purificar la tercera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HP en SP- Sepharose para formar una cuarta preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado; y (10) concentrar la cuarta preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado para formar una segunda preparación concentrada de moléculas del TFPI o análogo del TFPI purificadas, en la que menos de aproximadamente el 12% de las moléculas del TFPI o análogo del TFPI son moléculas del TPFI o análogo del TPFI modificadas. 12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el promotor de la transcripción es un promotor reclac. 13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el sitio de unión del ribosoma es el sitio de unión del ribosoma del gen 10 del bacteriófago T7. 14. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la secuencia de nucleótidos codificadora codifica ala-TPFI. 15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la secuencia de nucleótidos codificadora es ID SEC Nº 44. 16. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el terminador de la transcripción comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en ID SEC Nº 42. 17. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el replicón comprende un origen de replicación de pBR322. 18. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el replicón comprende un gen de control del número de copias rop del pBR322. 19. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el gen de resistencia a los antibióticos es el de la estreptomicina adeniltransferasa. 42 ES 2 367 563 T3 20. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la enzima que elimina la metionina del extremo N terminal es la metionina aminopeptidasa de E. coli. 21. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la célula huésped de E. coli es MON210 (Nº de acceso ATCC PTA-5564). 22. Un procedimiento para purificar moléculas del TPFI o análogo del TPFI, que comprende las etapas de: (1) purificar las moléculas del TFPI o análogo del TFPI producidas de manera recombinante por cromatografía de flujo rápido en SP-Sepharose para formar una primera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado; (2) concentrar la primera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado para formar una primera preparación concentrada del TFPI o análogo del TFPI purificado; (3) purificar la primera preparación concentrada del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HP en Q-Sepharose para formar una segunda preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado; (4) purificar la segunda preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HIC con butilo para formar una tercera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado; (5) purificar la tercera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HP en SP- Sepharose para formar una cuarta preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado; (6) concentrar la cuarta preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado para formar una segunda preparación concentrada de moléculas del TFPI o análogo del TFPI purificadas, en la que menos de aproximadamente el 12% de las moléculas del TFPI o análogo del TFPI son moléculas del TPFI o análogo del TPFI modificadas. 23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que la cromatografía de flujo rápido en SP-Sepharose se lleva a cabo en presencia de Mg ++ . 24. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que las moléculas del TFPI o análogo del TPFI se producen en células de levadura. 25. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que las moléculas del TPFI o análogo del TPFI se producen en células de mamífero, tales como las células CHO, células HepG2, células hepáticas Chang o células de hepatoma SK. 26. La preparación purificada de la reivindicación 1 o la formulación farmacéutica de la reivindicación 10, que comprende al menos 200 gramos del TPFI o análogo del TPFI. 27. La preparación purificada o la formulación de la reivindicación 26, que comprende 1,2 kilogramos o 2,4 kilogramos de inhibidor de la vía del factor tisular (TPFI) o análogo del TPFI. 28. La preparación purificada o la formulación de la reivindicación 26, que comprende 200-300 gramos de inhibidor de la vía del factor tisular (TPFI) o análogo del TPFI. 29. La preparación purificada o la formulación de la reivindicación 26, que comprende 400-600 gramos de inhibidor de la vía del factor tisular (TPFI) o análogo del TPFI. 30. La preparación purificada o la formulación de la reivindicación 26, que comprende 600-900 gramos de inhibidor de la vía del factor tisular (TPFI) o análogo del TPFI. 31. La preparación purificada o la formulación de la reivindicación 26, que comprende 800-1200 gramos de inhibidor de la vía del factor tisular (TPFI) o análogo del TPFI. 32. La preparación purificada o la formulación de la reivindicación 1 o 10, en la que la medición indirecta de ácido aspártico comprende analizar un subproducto S-adenosil-homocisteína (SAH) por RP-HPLC, en la que el subproducto es generado a partir de la transferencia de un grupo metilo de la S-adenosil-L-metionina (SAM) al ácido aspártico, catalizada por la Proteína Isoaspartil Metil Transferasa (PIMT). 33. Una formulación farmacéutica que comprende una preparación purificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o 26-32. 43 ES 2 367 563 T3 44 ES 2 367 563 T3 ES 2 367 563 T3 46 ES 2 367 563 T3 47 ES 2 367 563 T3 48 ES 2 367 563 T3 49 ES 2 367 563 T3 ES 2 367 563 T3 51 ES 2 367 563 T3 52 ES 2 367 563 T3 53 ES 2 367 563 T3 54 ES 2 367 563 T3 ES 2 367 563 T3 56 ES 2 367 563 T3 57 ES 2 367 563 T3 58 ES 2 367 563 T3 59 ES 2 367 563 T3 ES 2 367 563 T3 61