PROCEDIMIENTO Y KIT PARA LA IDENTIFICACION DE LAS PRINCIPALES ESPECIES COMERCIALES DE LANGOSTINOS Y CAMARONES.

Procedimiento y kit para la identificación de las principales especies comerciales de langostinos y camarones.



Procedimiento y kit para la identificación de las principales especies comerciales de langostinos o camarones (Orden Decapoda) pertenecientes a las familias Penaeidae (Penaeus monodon, Farfantepenaeus notialis, Fenneropenaeus indicus, Fenneropenaeus merguiensis, Litopenaeus vannamei) Solenoceridae (Pleoticus muelleri) y Pandalidae (Pandalus borealis), en productos y subproductos frescos, refrigerados, congelados y/o elaborados.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200930424.

Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: GALLARDO ABUIN,JOSE MANUEL, BARROS TAJES,LORENA, MEDINA MENDEZ,ISABEL, ORTEA GARCIA,IGNACIO.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K7/00 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › Péptidos con 5 a 20 aminoácidos en una secuencia totalmente determinada; Sus derivados.
  • C12Q1/48 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una transferasa.
  • G01N27/00 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › Investigación o análisis de materiales mediante el empleo de medios eléctricos, electroquímicos o magnéticos (G01N 3/00 - G01N 25/00 tienen prioridad; medida o ensayo de variables eléctricas o magnéticas o de las propiedades eléctricas o magnéticas de los materiales G01R).

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Fragmento de la descripción:

Procedimiento y kit para la identificación de las principales especies comerciales de langostinos y camarones.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la bioquímica y de la taxonomía, y se refiere a un procedimiento rápido mediante espectrometría de masas, para la identificación de las principales especies comerciales de langostinos o camarones (Orden Decapoda) pertenecientes a las familias Penaeidae (Penaeus monodon, Farfantepenaeus notialis, Fenneropenaeus indicus, Fenneropenaeus merguiensis, Litopenaeus vannamei) Solenoceridae (Pleoticus muelleri) y Pandalidae (Pandalus borealis). Este procedimiento permite la identificación inequívoca de la especie concreta en productos y subproductos frescos, refrigerados, congelados y/o elaborados, de indiscutible aplicación en los sectores alimentario, importador, sanitario y de control de calidad.

Estado de la técnica anterior

En la actualidad, dentro del mercado de los productos pesqueros, los langostinos y camarones son productos de gran valor. Así, en 2004 representaban el 16.5% del total del mercado internacional de productos pesqueros y su producción mundial en 2006 fue de unos 6.5 millones de toneladas, equivalentes a un valor de más de 24.000 millones de dólares (FAO), producción que no ha dejado de crecer en los últimos años. Destacan las especies L. vannamei, con 2.300.000 toneladas, P. monodon, con 833.000 toneladas, y P. borealis, con 421.000 toneladas de producción (FIGIS - Fisheries Global Information System- FAO; http://www.fao.org/fishery/figis).

Diversos países, entre ellos los integrantes de la Unión Europea, destacan entre sus objetivos prioritarios lograr la transparencia en los mercados pesqueros y ofrecer al consumidor información fiable sobre los productos que van a consumir. Este hecho resulta fundamental en un mercado cada vez más globalizado, en el que se pueden encontrar varias especies distintas bajo una misma denominación. Este es el caso concreto de las especies de langostinos y camarones pertenecientes al Orden Decapoda, del que las especies más comerciales se engloban en la superfamilia Penaeoidea (familias Penaeidae y Solenoceridae) y la familia Pandalidae. La incorrecta catalogación, entre otras razones, debida a que especies de origen y características muy diversas no son adecuadamente identificadas, puede ocasionar problemas de sustituciones que afectarían tanto al etiquetado como a la actividad comercial del sector y al propio consumidor. Como el valor comercial varía según las especies y los productos derivados, las entidades administrativas deben proteger a los consumidores de casos de sustitución de especies, mediante medidas de control que aseguren un adecuado etiquetado del producto.

El control de origen y autenticidad de especies se hace más necesario cuanto mayor es la diversidad de especies susceptibles de ser comercializadas bajo el mismo nombre. En el mercado existe una notable heterogeneidad de las especies y géneros que constituyen las principales denominaciones comerciales de langostinos. Cabe destacar que bajo los términos "langostino banana", "langostino blanco" o "langostino tigre" se encuadran distintas especies de langostinos e incluso distintos géneros. Respecto a la captura, cuanto mayor es el grado de solapamiento geográfico entre los caladeros de las distintas especies, mayor es la frecuencia con la que se pueden pescar dos especies distintas y difícilmente distinguibles en una misma área. Así, por ejemplo, en el océano índico coexisten tres de las especies de langostinos más comerciales, P. monodon, F. indicus y F. merguiensis, las cuales son habitualmente capturadas en una misma pesquería. Y por último, cuanto mayor es el grado de procesado o manipulación del crustáceo previo a la venta, mediante procesos tales como el pelado, eviscerado, descabezado, etc., mayor es la dificultad de la identificación de los especímenes utilizados en dicho producto. A estas circunstancias hay que añadir la creciente exigencia del consumidor por estar adecuadamente informado de la composición de los alimentos en un mercado cada vez más liberalizado y global, y, por tanto, más expuesto a riesgos sanitarios imprevisibles.

Por todo lo anteriormente expuesto, es imprescindible lograr una información contrastada y veraz sobre la naturaleza y el origen de los alimentos, con lo cual a su vez se protegerán a los productos de calidad frente a casos de sustitución de especies, que dan lugar a fraudes al consumidor y a competencia desleal entre productores.

En materia de etiquetado a nivel internacional el Codex Alimentarius (una acción conjunta de la FAO y la OMS) es punto de referencia para armonizar las normas alimentarias a nivel mundial. Por otro lado, en la Unión Europea, el Reglamento (CE) nº 104/2000 establece la Organización Común de Mercados en el sector de los productos de la pesca y de la acuicultura, y dispone que "los Estados miembros establecerán y publicarán el Listado de denominaciones comerciales de especies pesqueras y de acuicultura". En España, el Real Decreto 1380/2002 y el Real Decreto 121/2004 - teniendo en cuenta la Ley 3/2001 de Pesca Marítima del Estado - regulan la identificación y el etiquetado de los productos de la pesca, la acuicultura y el marisqueo, congelados o ultracongelados el primero, y vivos, frescos, refrigerados o cocidos el segundo. Un requisito fundamental del etiquetado de productos pesqueros es la identificación clara del nombre de la especie utilizada.

La existencia de toda esta serie de normativas necesita herramientas fiables que permitan la identificación certera del origen y naturaleza del producto. Estas herramientas han de basarse en metodologías analíticas que identifiquen la especie a partir de la cual se ha elaborado el producto a analizar, aunque ya no existan indicios morfológicos o sensoriales. De hecho, solamente los expertos son capaces de identificar las especies mediante una serie de caracteres tanto morfológicos como anatómicos cuando el crustáceo se presenta intacto, ya sea fresco o congelado (Mafra et al., 2008. European Food Research and Technology, 227(3), 649-665). En cambio una vez procesado (pelado, congelado, descabezado, etc.), la mayoría de los caracteres morfológicos desaparecen por lo que la identificación se hace prácticamente imposible.

Como una primera alternativa a la identificación morfológica para las especies de langostinos del Orden Decapoda, se abordaron herramientas analíticas encaminadas al análisis de las proteínas procedentes de sus tejidos. Los primeros trabajos de investigación fueron dos estudios de An y colaboradores (An et al., 1988. Journal of Food Science, 53(2), 313-318; An et al., 1989. Journal of Food Science, 54(2), 233-236), utilizando SDS-PAGE el primero e isoelectroenfoque el segundo. En estos trabajos sólo se incluyeron tres especies minoritarias (Penaeus duorarum, Penaeus setiferus y Sicyonia brevirostris), consiguiendo distinguir el segundo estudio entre las tres especies, pero no cuando se presentaba una mezcla con dos de las especies.

Más recientemente, se han propuesto dos métodos basados en el análisis del ADN para la identificación de especies de langostinos y camarones. En el primero (Khamnamtong et al., 2005. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 38(4), 491-499) se cita un método para la identificación de especies de langostinos peneideos en base al polimorfismo del gen 16S rRNA, utilizando polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) y polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP), previa amplificación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En este estudio se pudo identificar distintivamente las especies P. monodon, L. vannamei y F. merguiensis, pero no la Penaeus semisulcatus y la Marsupenaeus japonicus. En el segundo de los estudios basados en ADN (Pascoal et al., 2008. Electrophoresis, 29(2), 499-509) se recoge un método, que ha sido patentado (PCT/ES2007/070212), para la identificación de especies de langostinos de la superfamilia Penaeoidea utilizando la combinación de PCR y RFLP, en el que es necesario el corte con 3 enzimas de restricción distintos para conseguir una correcta identificación de las especies. Estos mismos autores describen otro método, también utilizando PCR y RFLP, para un número menor de especies (Pascoal et al., 2008. Electrophoresis, 29 (15), 3220-3228).

Las técnicas de Biología Molecular no se han aplicado a la especie Pandalus borealis, conocida... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento de obtención de datos útiles para la identificación de especies de langostinos y camarones que comprende:

a. extraer las proteínas sarcoplásmicas del músculo blanco de una muestra biológica aislada,

b. digerir las proteínas del extracto sarcoplásmico del paso (a), e

c. identificar la presencia o ausencia en el extracto digerido del paso (b) de los péptidos que se seleccionan de la lista que comprende: S-PEN829 (SEQ ID NO: 1), S-MUE643 (SEQ ID NO: 2), S-BOR817 (SEQ ID NO: 3), S-PEN759 (SEQ ID NO: 4), S-PEN675 (SEQ ID NO: 5), S-PEN539 (SEQ ID NO: 6), S-PEN603 (SEQ ID NO: 7).

2. Procedimiento para la identificación de especies de langostinos y camarones que comprende los pasos (a) - (c) según la reivindicación anterior, y además comprende:

d1. asignar la muestra biológica del paso (a) como perteneciente a la especie Pleoticus muelleri de la Familia Solenoceridae, si el péptido identificado en el paso c) es S-MUE643 (SEQ ID NO: 2).

3. Procedimiento para la identificación de especies de langostinos y camarones que comprende los pasos (a) - (c) según la reivindicación 1, y además comprende:

d2. asignar la muestra biológica del paso (a) como perteneciente a la especie Pandalus borealis de la Familia Pandalidae, si el péptido identificado en el paso (c) es S-BOR817 (SEQ ID NO: 3).

4. Procedimiento para la identificación de especies de langostinos y camarones que comprende los pasos (a) - (c) según la reivindicación 1, y además comprende:

d3. asignar la muestra biológica del paso (a) como perteneciente a la Familia Penaeidae, si el péptido identificado en el paso (c) es S-PEN829 (SEQ ID NO: 1).

5. Procedimiento para la identificación de especies de langostinos y camarones según la reivindicación 4, que además comprende:

e1. asignar la muestra biológica del paso (a) como perteneciente a la especie Farfantepenaeus notialis, si en el paso (c) se identifica la ausencia del péptido S-PEN759 (SEQ ID NO: 4).

6. Procedimiento para la identificación de especies de langostinos y camarones según la reivindicación 4, que además comprende:

e2. asignar la muestra biológica del paso (a) como perteneciente a la especie P. monodon, si en el paso (c) se identifican los péptidos S-PEN675 (SEQ ID NO: 5) y S-PEN539 (SEQ ID NO: 6).

7. Procedimiento para la identificación de especies de langostinos y camarones según la reivindicación 4, que además comprende:

e3. asignar la muestra biológica del paso (a) como perteneciente a la especie Litopenaeus vannamei, si en el paso (c) se identifica la presencia del péptido S-PEN675 (SEQ ID NO: 5) y la ausencia del péptido S-PEN539 (SEQ ID NO: 6).

8. Procedimiento para la identificación de especies de langostinos y camarones según la reivindicación 4, que además comprende:

e4. asignar la muestra biológica del paso (a) como perteneciente a la especie Fenneropenaeus merguiensis, si en el paso (c) se identifica la presencia del péptido S-PEN603 (SEQ ID NO: 7) y la ausencia de los péptidos S-PEN675 (SEQ ID NO: 5) y S-PEN539 (SEQ ID NO: 6).

9. Procedimiento para la identificación de especies de langostinos y camarones según la reivindicación 4, que además comprende:

e5. asignar la muestra biológica del paso (a) como perteneciente a la especie Fenneropenaeus indicus, si en el paso (c) se identifica la presencia del péptido S-PEN759 (SEQ ID NO: 4) y la ausencia de los péptidos S-PEN675 (SEQ ID NO: 5), S-PEN539 (SEQ ID NO: 6), S-PEN603 (SEQ ID NO: 7).

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde la extracción a partir del músculo blanco se realiza por homogeneización y centrifugación de la muestra.

11. Procedimiento según la reivindicación anterior, donde la homogenización de la muestra se realiza con un extractante de baja fuerza iónica.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9-11, donde la centrifugación se realiza a 30.000 x g 10 min.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde la digestión de las proteínas del paso (b) se realiza con una enzima proteasa.

14. Procedimiento según la reivindicación anterior, donde la enzima es la tripsina.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde la digestión de las proteínas del paso (b) se realiza mediante hidrólisis química.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, donde la digestión de las proteínas del paso (b) se realiza mediante la aplicación de ultrasonidos focalizados de alta intensidad.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, donde la identificación de los péptidos S-PEN829 (SEQ ID NO: 1), S-MUE643 (SEQ ID NO: 2) y/o S-BOR817 (SEQ ID NO: 3), S-PEN759 (SEQ ID NO: 4), S-PEN675 (SEQ ID NO: 5), S-PEN539 (SEQ ID NO: 6), S-PEN603 (SEQ ID NO: 7) se realiza mediante espectrometría de masas.

18. Procedimiento según la reivindicación anterior, donde la identificación de los péptidos S-PEN829 (SEQ ID NO: 1), S-MUE643 (SEQ ID NO: 2) y/o S-BOR817 (SEQ ID NO: 3), S-PEN759 (SEQ ID NO: 4), S-PEN675 (SEQ ID NO: 5), S-PEN539 (SEQ ID NO: 6), S-PEN603 (SEQ ID NO: 7) se realiza mediante espectrometría de masas acoplada a cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

19. Procedimiento según la reivindicación anterior, donde el espectrómetro de masas acoplado a un sistema de cromatografía líquida de alta resolución trabajan en cualquiera de los siguientes modos Data Dependent, SIM (selected ion monitoring), SIRM (selected ion reaction monitoring) y SMIM (selected MS/MS ion monitoring).

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, donde la identificación de los péptidos S-PEN829 (SEQ ID NO: 1), S-MUE643 (SEQ ID NO: 2) y/o S-BOR817 (SEQ ID NO: 3), S-PEN759 (SEQ ID NO: 4), S-PEN675 (SEQ ID NO: 5), S-PEN539 (SEQ ID NO: 6), S-PEN603 (SEQ ID NO: 7) se realiza mediante un anticuerpo.

21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, donde la identificación de los péptidos S-PEN829 (SEQ ID NO: 1), S-MUE643 (SEQ ID NO: 2) y/o S-BOR817 (SEQ ID NO: 3), S-PEN759 (SEQ ID NO: 4), S-PEN675 (SEQ ID NO: 5), S-PEN539 (SEQ ID NO: 6), S-PEN603 (SEQ ID NO: 7) se realiza mediante un oligonucleótido.

22. Péptido S-PEN829 cuya secuencia aminoacídica consiste en la SEQ ID NO: 1.

23. Péptido S-MUE643 cuya secuencia aminoacídica consiste en la SEQ ID NO: 2.

24. Péptido S-BOR643 cuya secuencia aminoacídica consiste en la SEQ ID NO: 3.

25. Péptido S-PEN759 cuya secuencia aminoacídica consiste en la SEQ ID NO: 4.

26. Péptido S-PEN675 cuya secuencia aminoacídica consiste en la SEQ ID NO: 5.

27. Péptido S-PEN539 cuya secuencia aminoacídica consiste en la SEQ ID NO: 6.

28. Péptido S-PEN603 cuya secuencia aminoacídica consiste en la SEQ ID NO: 7.

29. Uso de los péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 22-28, para la generación de anticuerpos.

30. Uso de los anticuerpos según la reivindicación anterior, para la identificación de los péptidos según la reivindicación 20.

31. Kit para la identificación de especies langostinos y camarones que comprende los medios necesarios para la identificación de los péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 22-28.

32. Kit según la reivindicación anterior que además comprende los medios necesarios para llevar a cabo un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-21.


 

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