UN PROCEDIMIENTO Y KIT PARA EL DIAGNOSTICO DIFERENCIAL DE UNA ENFERMEDAD QUE CURSA CON AFECTACIÓN MUSCULAR.

Un procedimiento y kit para el diagnóstico diferencial de una enfermedad que cursa con afectación muscular en un sujeto humano,

que comprende determinar en una biopsia muscular obtenida de dicho sujeto humano las concentraciones de las proteínas β-F1-ATPasa, LDH-A y al menos una de las proteínas seleccionadas del grupo compuesto por PYGM, GAPDH, SDH y GPD1, determinar el índice β-F1-ATPasa/LDH-A entre las concentraciones de dichas proteínas, determinar si el valor obtenido de dicho índice y el valor de la concentración de una de las proteínas seleccionadas del grupo compuesto por PYGM, GAPDH, SDH y GPD1 están comprendidos entre unos determinados valores de referencia y realizar el diagnóstico de la enfermedad que cursa con afectación muscular en dicho sujeto humano evaluando el resultado del paso anterior. La enfermedad que cursa con afectación muscular es preferiblemente distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, γ-sarcoglicanopatía o lipofuccinosis ceroide neuronal.

UN PROCEDIMIENTO Y KIT PARA EL DIAGNOSTICO DIFERENCIAL DE UNA

CAMPO DE LA INVENCIÓN

El campo de la invención está relacionado con las siguientes áreas: ciencias médicas, diagnóstico y medidas encaminadas a establecer un diagnóstico. Específicamente, la presente invención está relacionada con la detección de la expresión de proteínas del metabolismo energético y su papel en el diagnóstico de enfermedades raras que cursan con afectación muscular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las células eucariotas obtienen energía en forma de ATP mediante dos procesos metabólicos, la fosforilación oxidativa que ocurre en la mitocondria y la glucolisis que tiene lugar en el citoplasma. Las dos actividades metabólicas, glucolisis y fosforilación oxidativa, están finamente reguladas e interconectadas mediante control metabólico de la actividad de las enzimas que intervienen en dichas vías en una regulación a corto plazo y/o mediante control genético en una regulación a largo plazo. Debe tenerse en cuenta además que las proteínas del metabolismo energético tienen la ventaja de ser muy abundantes en la célula, lo cual facilita su detección.

Las Enfermedades Raras son aquellas enfermedades con una prevalencia menor de 5 casos por cada 10.000 habitantes. El diagnóstico de muchas de estas enfermedades no es sencillo y pueden pasar años hasta que un paciente consigue un diagnóstico correcto. Dentro del grupo de las enfermedades raras, la presente invención se centra en varias enfermedades raras que cursan con afectación muscular: distrofia muscular de Duchenne (DMD) , distrofia muscular de Becker (DMB) , formas sintomáticas de DMD y DMB en mujeres portadoras (Xp21) , γsarcoglicanopatía y lipofuccinosis ceroide neuronal (NCL) .

El problema que plantea la técnica es proveer un procedimiento diagnóstico alternativo de las enfermedades mencionadas. La presente invención soluciona el problema técnico mediante el procedimiento descrito en reivindicaciones. El procedimiento de la invención presenta una alta sensibilidad y alta especificidad.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención es un procedimiento para el diagnostico diferencial de una enfermedad que cursa con afectación muscular en un sujeto humano, que comprende:

a) determinar en una biopsia muscular obtenida de dicho sujeto humano las concentraciones de las proteínas β-F1-ATPasa, LDH-A y al menos una de las proteínas seleccionadas del grupo compuesto por PYGM, GAPDH, SDH y GPD1, b) determinar el índice β-F1-ATPasa/LDH-A entre las concentraciones de dichas proteínas,

c) determinar si el valor obtenido en la etapa b) y el valor de la concentración de una de las proteínas seleccionadas del grupo compuesto por PYGM, GAPDH, SDH y GPD1 están comprendidos entre unos determinados valores de referencia y d) realizar el diagnóstico de la enfermedad que cursa con afectación muscular en dicho sujeto humano evaluando el resultado del paso c) .

En la presente invención, se entiende por “enfermedad que cursa con afectación muscular” a una enfermedad en la que se ve afectado el tejido muscular de un sujeto.

El nombre completo de las proteínas a las que se refieren las abreviaturas β-F1-ATPasa, LDH-A, PYGM, GAPDH, SDH y GPD1 se muestra a continuación (Tabla 1) .

Tabla 1

Proteína Nombre

SDH Succinato deshidrogenasa

β-F1-ATPasa Subunidad β de la H+-ATPasa

GAPDH Gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa

LDH-A Lactato deshidrogenasa isoforma A

GPD1 Glicerol fosfato deshidrogenasa 1

PYGM Glicógeno fosforilasa muscular

Una realización particular es el procedimiento de la invención, donde dicha enfermedad que cursa con afectación muscular es una distrofia muscular.

Una realización particular es el procedimiento de la invención, donde dicha enfermedad que cursa con afectación muscular está seleccionada entre el grupo compuesto por distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, forma sintomática de distrofia muscular de Duchenne o Becker en mujeres portadoras (Xp21) , γ-sarcoglicanopatía y lipofuccinosis ceroide neuronal.

La forma sintomática en mujeres portadoras es una manifestación de distrofia de Duchenne o Becker de herencia recesiva ligada al cromosoma X. El procedimiento de la invención se puede utilizar en el diagnóstico de esta forma sintomática en mujeres portadoras, puesto que sirven los mismos marcadores utilizados para diagnosticar distrofia muscular de Duchenne y distrofia muscular de Becker.

Una realización particular es el procedimiento de la invención, donde dicha enfermedad es distrofia muscular de Duchenne, siendo PYGM la proteína seleccionada en la etapa c) .

Una realización particular es el procedimiento de la invención, donde dicha enfermedad es distrofia muscular de Becker, siendo GAPDH la proteína seleccionada en la etapa c) .

Una realización particular es el procedimiento de la invención, donde dicha enfermedad es una γ-sarcoglicanopatía, siendo SDH la proteína seleccionada en la etapa c) .

Una realización particular es el procedimiento de la invención, donde dicha enfermedad es una lipofuccinosis ceroide neuronal, siendo PYGM o GPD1 la proteína seleccionada en la etapa c) .

La determinación de la concentración de las proteínas de la etapa a) se puede realizar mediante diversas técnicas ampliamente descritas en el estado de la técnica. A continuación se citan, sin que el alcance de la invención se restringa a las técnicas citadas, algunas técnicas que se encuentran dentro de este grupo: ELISA, western blot, microarray de proteínas, ensayos colorimétricos y espectrometría de masas.

Por tanto, una realización particular de la invención es el procedimiento de la invención, donde en la determinación de la concentración de las proteínas de la etapa a) se utiliza una técnica seleccionada entre el grupo compuesto por ELISA, western blot, microarray de proteínas, ensayos colorimétricos y espectrometría de masas.

Una realización particular es un kit para realizar el procedimiento de la invención, que comprende reactivos adecuados para la cuantificación de la concentración de las proteínas β-F1-ATPasa, LDH-A, PYGM, GAPDH, SDH y GPD1 en una biopsia muscular de un sujeto humano.

Otra realización es el kit de la invención, que comprende además instrucciones de uso de dichos reactivos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Se muestra la detección de la proteína LDH-A. Señales de fluorescencia obtenidas en el array.

Figura 2. Curva patrón del extracto de proteína de la línea celular derivada de carcinoma colorrectal humano, HCT116, utilizada en el estudio como valor de referencia.

Figura 3. Se muestra la detección de la proteína LDH-A. Detección por western blot del anticuerpo monoclonal contra la LDH-A. PR es la proteína recombinante, 293T es una línea celular embrionaria humana derivada de riñón y Hig es hígado.

MODOS DE REALIZACIÓN PREFERENTE

Ejemplo 1. Análisis de la expresión de proteínas del metabolismo energético en biopsias musculares.

Se procesaron crio-secciones de tejido procedente de individuos sanos y afectados de las siguientes patologías: Distrofia muscular de Duchenne (DMD) , Distrofia muscular de Becker (DMB) , formas sintomáticas de DMD y DMB en mujeres portadoras (Xp21) , γ-sarcoglicanopatía y lipofuccinosis ceroide neuronal. Las muestras (20 sanos y 53 patológicas) se proporcionaron identificadas por un código para proteger la identidad de los pacientes.

Las muestras de tejido congelado de la colección de pacientes sanos y patológicos se procesaron con el medio de extracción de proteínas T-PER® (Tissue Protein Extraction Reagent, 3747 N. Meridian Rd., Rockford, IL 61101 U.S.A) e inhibidores de proteasas y fosfatasa. Se homogeneizaron mecánicamente con la ayuda de un mortero. Para ello, se añadió T-PER en una proporción de 1/10 en P/V. Los homogeneizados se congelaron y descongelaron tres veces con nitrógeno líquido y, a continuación, se mantuvieron 20 minutos a 4ºC. Transcurrido este tiempo y tras 30 minutos de centrifugación a 4ºC y 12000 rpm se recogieron los sobrenadantes, que constituyeron el extracto proteico que se utilizó para evaluar la expresión de los distintos marcadores. La cantidad de proteína en estos sobrenadantes se determinó mediante el método Bradford® (BioRad, Hercules, CA, EE.UU) siguiendo las instrucciones del fabricante y usando una solución de BSA de concentración conocida como patrón de referencia.

Se imprimió 1 ng de proteína...

1. Un procedimiento para el diagnostico diferencial de una enfermedad que cursa con afectación muscular en un sujeto humano, que comprende: a) determinar en una biopsia muscular obtenida de dicho sujeto humano las concentraciones de las proteínas β-F1-ATPasa, LDH-A y al menos una de las proteínas seleccionadas del grupo compuesto por PYGM, GAPDH, SDH y GPD1, b) determinar el índice β-F1-ATPasa/LDH-A entre las concentraciones de dichas proteínas, c) determinar si el valor obtenido en la etapa b) y el valor de la concentración de una de las proteínas seleccionadas del grupo compuesto por PYGM, GAPDH, SDH y GPD1 están comprendidos entre unos determinados valores de referencia y d) realizar el diagnóstico de la enfermedad que cursa con afectación muscular en dicho sujeto humano evaluando el resultado del paso c) .

2. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha enfermedad que cursa con afectación muscular es una distrofia muscular.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha enfermedad que cursa con afectación muscular está seleccionada entre el grupo compuesto por distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, forma sintomática de distrofia muscular de Duchenne en mujeres portadoras (Xp21) , forma sintomática de distrofia muscular de Becker en mujeres portadoras (Xp21) , γ-sarcoglicanopatía y lipofuccinosis ceroide neuronal.

4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dicha enfermedad es distrofia muscular de Duchenne, siendo PYGM la proteína seleccionada en la etapa c) .

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dicha enfermedad es distrofia muscular de Becker, siendo GAPDH la proteína seleccionada en la etapa c) .

6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dicha enfermedad es una γ-sarcoglicanopatía, siendo SDH la proteína seleccionada en la etapa c) .

7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dicha enfermedad es una lipofuccinosis ceroide neuronal, siendo PYGM

o GPD1 la proteína seleccionada en la etapa c) .

8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que en la determinación de la concentración de las proteínas de la etapa a) se utiliza una técnica seleccionada entre el grupo compuesto por ELISA, western blot, microarray de proteínas, ensayos colorimétricos y espectrometría de masas.

9. Un kit para realizar el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende reactivos adecuados para la cuantificación de la concentración de las proteínas β-F1-ATPasa, LDH-A, PYGM, GAPDH, SDH y GPD1 en una biopsia muscular de un sujeto humano.

10. El kit según la reivindicación 9, caracterizado por que comprende además 10 instrucciones de uso de dichos reactivos.

Fig. 2

- 31 kDa

LDH-A

Fig. 3