Procedimiento de extracción de los ácidos desoxirribonucleicos (ADN) de microorganismos eventualmente presentes en una muestra de sangre.

Procedimiento de extracción de ADN de microorganismos presentes en una muestra de sangre que comprendelas siguientes etapas:

i) la filtración de una muestra de sangre a través de una membrana de filtración cuyos poros presentan undiámetro que va de 0,01 μm a 50 μm, en particular de 0,1 μm a 10 μm, y de manera más particular de 0,2 μm a 1&bu;m;

ii) el lavado de dicha membrana de filtración, en el cual dicho lavado lisa los glóbulos rojos de la muestra desangre; y

iii) la extracción de los ácidos desoxirribonucleicos de los microorganismos eventualmente presentes en dichamembrana de filtración.

La presente invención se refiere al campo de la detección y de la identificación de microorganismos eventualmente presentes en una muestra de sangre. Esta se refiere de manera más particular a un procedimiento de extracción de los ácidos desoxirribonucleicos (ADN) de microorganismos eventualmente presentes en una muestra de sangre para su identificación.

El desarrollo de métodos simples y rápidos que permitan la detección y/o la identificación y/o la determinación del porcentaje de microorganismos eventualmente presentes en una muestra de sangre es un reto fundamental en particular en el campo de la salud.

Actualmente, los métodos de biología molecular y, de manera particular, las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) están en plena expansión.

En efecto, estas técnicas presentan una gran sensibilidad y especificidad para la identificación y/o la cuantificación de los microorganismos. Sin embargo, la aplicación de estos métodos de biología molecular y, de manera particular, 20 las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) a muestras de sangre presenta dificultades, en particular en términos de sensibilidad y de realización.

En efecto, las muestras de sangre comprenden unos agentes inhibidores de las técnicas de biología molecular y en particular unas técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) .

Estos agentes inhibidores pueden interferir con los procedimientos de extracción de ADN y/o degradar los ácidos desoxirribonucleicos (ADN) de las células y/o inhibir la actividad de las enzimas, en particular de las polimerasas utilizadas en diferentes técnicas de biología molecular.

A título de ejemplo de este tipo de agentes inhibidores en concreto de las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) , en particular presentes en la sangre toral, se pueden citar los iones de calcio, la hemoglobina, la lactoferrina, la hemina, la urea y la heparina de la sangre (Al-Soud, W. A. y Radstrom, P. 2001. Purification and characterization of PCR-inhibitor y components in blood cells. J. Clin. Microbiol. 39: 2, págs. 485-493) . Sigue existiendo, por lo tanto, la necesidad de unos procedimientos de extracción de ADN de los microorganismos presentes en una muestra de sangre, para su detección y/o su identificación.

Los inventores han descubierto un procedimiento particular que permite resolver por completo o en parte los problemas mencionados con anterioridad.

De acuerdo con un primer aspecto, la invención tiene por objeto un procedimiento de extracción de ADN de los microorganismos eventualmente presentes en una muestra de sangre que comprende las siguientes etapas:

i) la filtración de una muestra de sangre a través de una membrana de filtración cuyos poros presentan un diámetro que va de 0, 01 μm a 50 μm, en particular de 0, 1 μm a 10 μm, y de manera más particular de 0, 2 μm a 1

μm; ii) el lavado de dicha membrana de filtración, en el cual dicho lavado lisa los glóbulos rojos de la muestra de sangre; y iii) la extracción de los ácidos desoxirribonucleicos de los microorganismos eventualmente presentes en dicha membrana de filtración.

Se entiende por « muestra de sangre » en el sentido de la presente invención una muestra de sangre completa o de hemocultivo, que se ha tratado eventualmente para reducir el nivel y/o eliminar los glóbulos rojos y/o las plaquetas presentes en dicha muestra.

La etapa de tratamiento de una muestra de sangre para reducir el nivel y/o eliminar los glóbulos rojos y/o las plaquetas presentes en dicha muestra se puede realizar de acuerdo con unas técnicas que conoce bien el experto en la materia.

A título de ejemplos de estas técnicas, se pueden citar las que se describen en la Solicitud PCT WO 03/025207: 60 -la técnica de agregación plaquetaria por medio de agentes de agregación como anticuerpos específicos de un antígeno plaquetario, seguida de la filtración de la muestra tratada;

-la técnica de aglutinación de los glóbulos rojos por medio de agentes de agregación como las lectinas, seguida 65 de la filtración de la muestra tratada.

Las muestras de sangre completa se pueden obtener de acuerdo con unas técnicas que conoce bien el experto en la materia por medio, por ejemplo, de una jeringuilla provista de una aguja que se introduce en particular en una vena del antebrazo o del pliegue del codo de un individuo. Una muestra de entre 1 y 10 ml de sangre extraída en particular con un anticoagulante, en particular EDTA, citrato de sodio o heparina, obtenida de un sujeto humano o animal puede ser suficiente para aplicar el procedimiento de acuerdo con la presente invención.

Las muestras de sangre de hemocultivo se pueden obtener tras la siembra de la sangre completa extraída de un humano o animal en unos medios de cultivo adecuados para el desarrollo de los microorganismos.

Una membrana de filtración adaptada para el procedimiento de acuerdo con la invención la puede identificar de forma simple el experto en la materia dados sus conocimientos generales.

En particular, la membrana de filtración de acuerdo con la invención se puede seleccionar dentro del grupo que comprende las membranas de fluoruro de polivinilideno, de poliéster, de nailon, de polipropileno, de policarbonato y

de polietersulfona, en particular de fluoruro de polivinilideno.

De preferencia, dicha membrana de filtración no es a base de celulosa.

La etapa i) de filtración del procedimiento de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo por medio de dispositivos y de soportes de filtro que conoce bien el experto en la materia, en particular un soporte como el que se describe en la Solicitud de Patente US 2004/0208796.

En la etapa ii) se entiende por « lavado » una etapa que permite reducir el nivel de impurezas retenidas en la membrana de filtración permitiendo al mismo tiempo que al menos una parte de los microorganismos se mantengan en dicha membrana.

Las impurezas pueden ser, en particular, agentes inhibidores de las técnicas de biología molecular (Wilson, J.G. 1997. Inhibition and Facilitation of Nucleic Acid Amplification. Appl. Environ. Microbiol. 63: 10, págs. 3.741-3.751) , en particular:

-proteínas plasmáticas, las inmunoglobulinas G (Al-Soud, W. A., Jonsson, L. J., y Radstrom, P. 2000. Identification and characterization of immunoglobulin G in blood as a major inhibitor of diagnostic PCR. J. Clin. Microbiol. 38: 1, págs. 345-350) ;

-enzimas (proteasas) ;

-poliaminas;

-polianetol sulfonato de sodio (SPS) ;

-anticoagulantes sanguíneos como la heparina (Satsangi, J., Jewell, D. P., Welsh, K., Bunce, M., y Bell, J. I. 1994. Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet 343: 8.911, págs. 1.509-1.510) y el ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) (Al-Soud, W. A. y Radstrom, P. 2001. Purification and characterization of PCR-inhibitor y components in blood cells. J. Clin. Microbiol. 39: 2, págs. 485-493) ;

-la hemoglobina, la hemina (Akane, A., Matsubara, K., Nakamura, H., Tahahashi, S., y Kimura, K. 1994. Identification of the heme compound copurified with deoxyribonucleic acid (DNA) from bloodstains, a major inhibitor of polymerase chain reaction (PCR) amplification. J. Forensic Sci. 39: 2, págs. 362-372) , la bilirrubina, los fenoles;

-detergentes como el dodecil sulfato de sodio, el Triton X100; y

-los ácidos biliares.

Dicha etapa ii) permite lisar, en particular mediante choque hipotónico, los glóbulos rojos de la muestra de sangre y, en concreto, eliminar su contenido, en particular la hemoglobina contenida en estos glóbulos rojos.

El experto en la materia podrá determinar de forma simple el volumen de solución de lavado utilizada en la etapa ii) dados sus conocimientos generales.

El volumen de solución de lavado puede corresponder a un volumen comprendido entre ¼ y 20, en particular entre ½ y 10 y, de manera más particular entre 1 y 5 veces el volumen de la muestra de sangre filtrada en la etapa i) .

Por ejemplo, cuando la muestra de sangre filtrada en la etapa i) tiene un volumen que va de 0, 2 a 5 ml y de manera 65 más particular de 0, 5 a 1 ml, entonces la etapa ii) de lavado se puede llevar a cabo con un volumen de solución de lavado que va de 1 a 10 ml, en particular de 3 a 5 ml, y de manera más particular de 3 ml.

También a título de ejemplo, cuando la muestra de sangre filtrada en la etapa i) tiene un volumen que va de 5 a 100 ml, de manera más particular de 5 a 20 ml, entonces la etapa ii) de lavado se puede llevar a cabo con un volumen de solución de lavado que va de 5 a 50 ml, en particular de 8 a 20 ml, y de manera... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de extracción de ADN de microorganismos presentes en una muestra de sangre que comprende las siguientes etapas:

i) la filtración de una muestra de sangre a través de una membrana de filtración cuyos poros presentan un diámetro que va de 0, 01 μm a 50 μm, en particular de 0, 1 μm a 10 μm, y de manera más particular de 0, 2 μm a 1 μm; ii) el lavado de dicha membrana de filtración, en el cual dicho lavado lisa los glóbulos rojos de la muestra de sangre; y iii) la extracción de los ácidos desoxirribonucleicos de los microorganismos eventualmente presentes en dicha membrana de filtración.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que comprende, además, la siguiente etapa:

iv) la identificación de los microorganismos, en particular de las bacterias, de los virus, de los protozoos y/o de los hongos eventualmente presentes en dicha muestra de sangre.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado por que la etapa iv) comprende el uso de una técnica de biología molecular que utiliza una actividad de tipo polimerasa seleccionada dentro del grupo que comprende la reacción en cadena de la polimerasa en punto final, la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, la reacción en cadena de la polimerasa multiplex, la reacción en cadena de la polimerasa cualitativa, la reacción en cadena de la polimerasa semicuantitativa y la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa.

4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que comprende, además, la siguiente etapa:

v) la identificación de al menos un gen de resistencia a un antibiótico en al menos un microorganismo presente en dicha muestra de sangre. 30

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por que la etapa v) comprende el uso de una técnica de reacción en cadena de la polimerasa.

6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que comprende, 35 además, la siguiente etapa:

vi) la determinación de la cantidad de microorganismos, en particular de bacterias, virus, protozoos y/u hongos presentes en dicha muestra de sangre.

7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que dicha membrana de filtración se selecciona dentro del grupo que comprende las membranas de fluoruro de polivinilideno, de poliéster, de nailon, de polipropileno, de policarbonato y de polietersulfona, en particular de fluoruro de polivinilideno.

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que dicha membrana de filtración no es a base de celulosa.

9. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que dicha muestra de sangre se selecciona dentro del grupo que comprende:

-una muestra de sangre de sangre completa; y -una muestra de sangre de hemocultivo.

10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que comprende, 55 de forma previa a la etapa i) , las siguientes etapas:

a) la adición a la sangre completa o al hemocultivo de una solución de aglutinación de los glóbulos rojos y/o de una solución de agregación plaquetaria; y b) la filtración de la preparación obtenida en la etapa a) a través de un filtro cuyos poros presentan un diámetro 60 que va de 2 μm a 50 μm, en particular que va de 10 μm a 25 μm, y de manera más particular de 17 μm.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado por que dicha solución de aglutinación comprende al menos un agente de aglutinación seleccionado dentro del grupo que comprende las lectinas, la polietilenimina, la polivinilpirrolidona, las gelatinas, los dextranos y los polietileno glicoles, en particular las lectinas de 65 lens culinaris.

12. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado por que dicha solución de agregación plaquetaria comprende al menos un agente de agregación plaquetaria seleccionado dentro del grupo que comprende los anticuerpos específicos de un antígeno plaquetario, la trombina, la tripsina, el colágeno, el tromboxano A2, el factor de activación plaquetaria, la adrenalina, el ácido araquidónico, la serotonina y la epinefrina, en particular los anticuerpos específicos de un antígeno plaquetario y el colágeno.

Control - E. coli E. coli E. coli Control +

Ct 0, 0 35, 3 37, 1 35, 2 30, 9

amplitud -322, 2 385, 7 223, 0 253, 0 499, 6

FIGURA 1B

Control - S. epidermidis S. epidermidis S. epidermidis Control +

Ct 0, 0 34, 9 35, 0 35, 0 30, 3

amplitud 0 242, 3 237, 6 274, 0 779, 0

FIGURA 2B

Control - Control + ADN 1/100 ADN 1/500 ADN 1/1.000 ADN 1/5.000 ADN 1/10.000 ADN 1/50.000

Ct 0, 0 29, 3 27, 47 31, 40 33, 60 35, 50 0 0

amplitud 42 546 372, 4 334, 7 159, 5 162, 1 20, 4 1, 63

FIGURA 3B