Procedimiento para fabricar conjugados que presentan un componente nanoparticular que contiene un metal y un componente orgánico,

mediante aportación de un fluido portador (4) en un recipiente (1), colocando un cuerpo metálico (6), que presenta metal u óxido de metal, en el fluido portador (4), generando nanopartículas que contienen metal mediante irradiación de la superficie del cuerpo metálico (6) con rayo láser, moviéndose el fluido portador (4) mediante un equipo de bomba (5) sobre la superficie del cuerpo metálico (6) y mezclándose el fluido portador (4) con un compuesto precursor del componente orgánico.

Procedimiento y dispositivo para fabricar compuestos orgánicos que contienen metales.

La invención se refiere a dispositivos y procedimientos que pueden realizarse con los mismos para fabricar compuestos que contienen metales, que presentan un componente metálico nanoparticular y un componente orgánico o que están compuestos por los mismos. El componente orgánico tiene preferiblemente una afinidad con un analito, en particular con un componente de la célula. Alternativamente puede ser el componente orgánico una molécula natural o sintética, en particular un monómero o polímero.

Petersen, Jakobi y Barcikowski, Applied Surface Science (ciencia aplicada de las superficies) 5435-5438 (2009) y Petersen y Barcikowski, Advanced Functional Materials (materiales funcionales avanzados) , 1167-1172 (2009) describen la fabricación de conjugados de nanopartículas con oligonucleótidos mediante ablación in situ de una lámina de oro por medio de impulsos de láser ultracortos en solución acuosa.

Tarea de la invención

Es tarea de la invención proporcionar un procedimiento y un dispositivo adecuado para realizar el procedimiento para fabricar conjugados que contienen metales.

Descripción general de la invención La invención soluciona la tarea con el procedimiento y el dispositivo definidos en las reivindicaciones. Al respecto proporciona la invención un procedimiento para fabricar, preferiblemente para fabricar continuamente, conjugados que presentan un componente metálico nanoparticular y un componente orgánico o que están compuestos por los mismos. El procedimiento aprovecha la generación de nanopartículas que contienen metales activados o reactivos mediante irradiación de un cuerpo metálico con radiación láser y evita la modificación o el daño debido a la irradiación con láser de componentes orgánicos de tales conjugados.

El componente metálico nanoparticular incluye o está compuesto preferiblemente por metales de resonancia plasmónica, en particular Au, Ag, Ti y/o Cu. El componente metálico nanoparticular del compuesto fabricado mediante el procedimiento correspondiente a la invención se encuentra preferiblemente en forma metálica, en particular está elegido a partir del grupo que incluye el oro, plata, tinanio, platino, iridio, tántalo, hierro, níquel, cobalto y cobre y mezclas de los mismos, en particular aleaciones de hierro-níquel y aleaciones de cobalto-samario, aleaciones de oro-plata (AuAg) , aleaciones de hierro-oro (FeAu) y aleaciones de níquel-titanio (NiTi) o como óxido metálico, en particular elegido a partir del grupo que incluye óxidos de titanio, cinc y hierro, en particular óxidos metálicos ferromagnéticos de los mismos. Además, preferiblemente es también el componente nanoparticular metálico una partícula núcleo-cubierta, cuyo núcleo es metálico y cuya cubierta es el óxido del mismo metal, por ejemplo Zn (núcleo) /ZnO (cubierta) . Se ha comprobado que el procedimiento de fabricación correspondiente a la invención, en particular cuando se utiliza un fluido portador que contiene oxígeno, por ejemplo alcohol o agua, genera partículas con un núcleo metálico y una cubierta de óxido metálico.

Para la estabilidad del enlace del componente metálico con el componente orgánico de conjugados, es preferible que uno de estos componentes sea una base Lewis débil, mientras que el otro es un ácido Lewis débil, o bien uno de estos componentes es una base Lewis fuerte, mientras que el otro componente es un ácido Lewis fuerte, por ejemplo Au con un componente orgánico que contiene grupos tiol o bien Fe con un componente orgánico que contiene grupos amino.

El enlace entre el componente metálico nanoparticular y el componente orgánico es preferiblemente un enlace directo, pudiendo presentar opcionalmente el componente orgánico un llamado grupo espaciador, por ejemplo un alquilo C1 a C6 o un poliglicol, en particular hexaetilenglicol, enlazando el grupo espaciador con el componente metálico.

El componente orgánico del enlace orgánico que contiene metal es una base Lewis y puede presentar un grupo susceptible de reacción, por ejemplo elegido a partir de enlaces dobles C-C, en particular enlaces dobles etilénicamente insaturados, grupos carboxilo, carbonilo, tiol, sulfuro y epóxido, en particular con grupo tiol terminal, como por ejemplo un radical de cisteina, un radical de alquiltiol o etilenglicoltiol o un bisulfuro, por ejemplo un bisulfuro de piridilo, bisulfuro de alquilo C1 a C12, un bisulfuro de etilenglicol o ácido lipoico.

En una forma de ejecución preferente presenta el componente orgánico una secuencia de ácido nucleínico y/o una secuencia de aminoácido con una afinidad específica con un analito, en particular una afinidad específica con un componente intracelular o extracelular de una célula procariótica o eucariótica, en particular una célula animal. Preferiblemente presenta el componente orgánico una secuencia de ácido nucleínico, también denominada oligonucleótido, que por ejemplo es complementario inverso es decir, hibridizable, de una secuencia objetivo que es el analito. De manera especialmente preferente es el componente orgánico una secuencia de ácido nucleínico, que es específico de un segmento específico de cromosomas de sexo de una célula animal, en particular de una célula de esperma.

En otra forma de ejecución presenta el componente orgánico los componentes que ligan un antígeno de un anticuerpo, por ejemplo una o varias cadenas de aminoácidos, que forman un paratope de un anticuerpo, en particular un anticuerpo natural o sintético o un componente de un anticuerpo que liga un antígeno.

Correspondientemente puede ser el componente orgánico un componente de enlace del componente correspondiente a la invención, por ejemplo un anticuerpo natural o sintético, de una cadena o de dos cadenas, en particular una secuencia de ácido nucleínico, que actualmente se indican en 5' después de 3', por ejemplo RNA, ADN, ADN fosforilado (PSNA) , ADN peptidil, por ejemplo LNA (locked nucleic acid, ácido nucléico bloqueado) o PNA, o un ligando específico del receptor, p.e. para un receptor celular, u otro compuesto que interactúa específicamente con un componente ligado a la superficie de una célula o un componente interno de la célula, en particular un anticuerpo.

Una secuencia de ácido nucleínico, que es parte integrante orgánica de un conjugado correspondiente a la invención, puede presentar por ejemplo una secuencia de ácido nucleínico específica de un cromosoma del sexo, allel o SNP.

Secuencias de ácido nucleínico preferentes son TCT GTG AGA CGA CGC ACC GGT CGC AGG TTT TGT CTC ACA (ID sec. Núm. 1) , la secuencia específica del cromosoma Y del vacuno AGA GAC TGT GGA ACC GG (ID sec. Núm 2) GGC GAC TGT GCA AGC AGA (ID sec. núm. 3) o AGC ACA TCT CGG TCC CTG (ID sec. núm. 4) o un cartucho de expresión que codifica un gen marcador, por ejemplo una proteína luminiscente, en particular GFP, eGFP, Red, una secuencia específica de un marcador de enfermedad, por ejemplo la GGG AGG GCG AUG CGG AUC AGC CAU GUU UAC GUC ACU CCU UGU CAA UCC UCA UCG GC especifica del antígeno de membrana de la próstata (ID sec. Núm. 5) o una secuencia codificadora de siRNA, por ejemplo la siRNA ACC UUC AGG GUC AGC UUG C dirigida contra GFP (ID sec. Núm. 6) .

Para componentes orgánicos de conjugados correspondientes a la invención, que presentan una afinidad específica con un analito, se denominan los conjugados correspondientes a la invención también conjugados de comprobación o detección.

Es preferible que los conjugados correspondientes a la invención, en particular los conjugados de detección, en los que una nanopartícula que contiene metal está unida con un componente orgánico, que presenta una afinidad específica para una analito, presenten compuestos ligados adicionalmente que refuerzan la penetración, por ejemplo péptidos de poliarginina, en particular preferiblemente con un residuo de ácido mirístico ligado y/o un agente de transfección, por ejemplo elegido a partir del grupo que incluye Fugene, lipofectamina, oligofectamina, Optifect, DMRIE C, AntHD, penetratina (ID de sec. Núm. 7, RQIKIWFQNRRMKWKK) penetratina 43-58, proteína HIVI-Tat (ID sec. núm. 8, GRICKKRRQRPRPPQ) , péptido tat 49-59, péptido tat 48-52, péptido tat 2-4, péptidos que contienen la secuencia ID núm. 9 (YGRKIGZRQRRRGYGRKKRRQRRRG) o que están compuestos por la misma, péptidos amfipáticos (MAPs) , por ejemplo la secuencia de aminoácidos KALA ó KLAL, péptidos que contienen cis-γ-amino-Lprolina,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para fabricar conjugados que presentan un componente nanoparticular que contiene un metal y un componente orgánico, mediante aportación de un fluido portador (4) en un recipiente (1) , colocando un cuerpo metálico (6) , que presenta metal u óxido de metal, en el fluido portador (4) , generando nanopartículas que contienen metal mediante irradiación de la superficie del cuerpo metálico (6) con rayo láser, moviéndose el fluido portador (4) mediante un equipo de bomba (5) sobre la superficie del cuerpo metálico (6) y mezclándose el fluido portador (4) con un compuesto precursor del componente orgánico.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la radiación láser es una radiación láser continua.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la radiación láser es generada por un láser CW (8) de onda continua.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la radiación láser es una radiación láser de impulsos ultracortos.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el fluido portador (4) se mezcla con el compuesto precursor antes de moverse sobre la

superficie del cuerpo metálico (δ) .

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado porque el cuerpo metálico (6) está formado por una sola pieza o bien es un metal particular u oxido metálico.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado porque el fluido portador (4) se mezcla con compuesto precursor del componente orgánico, después de haberse movido sobre la superficie del cuerpo metálico (6) .

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado porque el recipiente (1) está configurado como canal de flujo y el cuerpo metálico (6) está dispuesto en un segmento del canal del flujo entre una abertura de entrada (2) en un primer extremo del recipiente (1) y una abertura de salida (3) en un segundo extremo del recipiente (1) y el fluido portador (4) se mueve desde la abertura de entrada (2) hacia la abertura de salida (3) .

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado porque el fluido portador (4) se mueve en flujo turbulento sobre la superficie del cuerpo metálico (6) .

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado porque al fluido portador se le añade al menos otro compuesto precursor de un componente orgánico, antes o después de que el fluido portador (4) se mueva sobre la superficie del cuerpo metálico (6) .

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado porque el fluido portador (4) se acumula en el extremo de salida (3) y se separa el compuesto precursor no transformado con nanopartículas y/o nanopartículas no transformadas con compuesto precursor del conjugado.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 8 a 11,

caracterizado porque al menos una parte del fluido portador se devuelve del extremo de salida (3) al extremo de entrada (2) .

13. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado por la generación de una señal de medida cuando se detecta al menos una característica del fluido portador (4) en un segmento de cubeta (12) del recipiente (1) .

14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque la detección es una detección espectrométrica o una dispersión dinámica de la luz.

15. Procedimiento según la reivindicación 12,

caracterizado porque a partir de la señal de medida procedente de la detección del fluido portador, se genera una señal de control para la radiación láser y la misma controla la radiación láser y/o un movimiento relativo de la radiación láser respecto al cuerpo metálico y/o la adición de compuesto precursor al fluido portador.

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado porque el primer compuesto precursor está elegido a partir del grupo que incluye oligonucleótidos, péptidos, poliéter, poliéster, poliamida y monómeros con al menos un grupo reactivo, elegido entre enlaces C-C insaturados, grupos bisulfuro, tiol, ceto, carboxi, fosfino, amino y amida.

17. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado porque el metal es oro (Au) y el primer compuesto precursor es un oligonucleótido específico del cromosoma de sexo.

18. Aplicación de un procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes para identificar un analito intracelular o extracelular, siendo específico el primer compuesto precursor para los analitos y detectándose la presencia del componente nanoparticular que contiene metal del conjugado en células.

19. Aplicación según la reivindicación 18,

caracterizada porque las células se clasifican en función de la detección del componente nanoparticular del conjugado en células mediante citometría de flujo en fracciones.

20. Dispositivo para aplicarlo en un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 15 con un recipiente (1) para alojar un fluido portador (4) , un equipo de circulación unido con el recipiente (1) para mover el líquido portador en el recipiente (1) y un equipo de fijación (7) dispuesto dentro del recipiente (1) para fijar un cuerpo metálico (6) , presentando el recipiente una abertura de entrada (2) para la entrada del fluido portador (4) y una abertura de salida (3) para la salida del fluido portador (4) , con un láser (8) equipado para generar radiación láser y orientarlo al segmento del equipo de fijación (7) en el que ha de disponerse el cuerpo metálico (6) .

21. Dispositivo según la reivindicación 20,

caracterizado porque el equipo de circulación es una tubería de circulación conectada al recipiente (1) con un equipo de bomba, o bien un equipo de bomba (5) dispuesto en el recipiente (1) .

22. Dispositivo según la reivindicación 20 ó 21,

caracterizado porque el recipiente (1) está configurado como canal de flujo, que en su primer extremo presenta la abertura de entrada (2) y en su segundo extremo opuesto presenta la abertura de salida (3) , estando dispuesto el equipo de fijación (7) en un segmento del canal de flujo entre la abertura de entrada (2) y la abertura de salida (3) y el canal de flujo presenta un segmento (11) transparente para la radiación láser generada por el láser (8) , a través del cual está dirigida la radiación láser.

23. Dispositivo según una de las reivindicaciones 20 a 22,

caracterizado porque el canal del flujo presenta un segmento de cubeta (12) que presenta una primera pared de cubeta (13) y una segunda pared de cubeta (14) distanciada de la anterior y en la primera pared de cubeta (13) está dispuesto un sensor (22) para medir al menos una característica del fluido portador (4) y/o de un conjugado.

24. Dispositivo según la reivindicación 23,

caracterizado porque la primera pared de la cubeta (13) es ópticamente transparente y el sensor (22) es un fotómetro.

25. Dispositivo según la reivindicación 23 o 24,

caracterizado porque la segunda pared de la cubeta (14) es ópticamente transparente y está dispuesta una fuente de radiación en la segunda pared de la cubeta (14) y está orientada hacia la primera pared de la cubeta (13) .

26. Dispositivo según la reivindicación 23 o 24, 5 caracterizado porque la segunda pared de la cubeta (14) es un espejo.

27. Dispositivo según una de las reivindicaciones 18 a 23, caracterizado porque a la abertura de salida (3) está conectada una tubería de retorno (23) dotada de una válvula, estando unida dicha tubería con la abertura de entrada (2) .

28. Dispositivo según una de las reivindicaciones 20 a 27, 10 caracterizado porque el láser (8) está equipado para generar una radiación láser continua.

29. Dispositivo según una de las reivindicaciones 20 a 28, caracterizado porque el recipiente (1) presenta en un segmento entre el equipo de fijación (7) y la abertura de salida (3) una segunda abertura de entrada (16) , que está unida con un equipo dosificador (15) intercalado con un primer depósito (17) para alojar un primer y/o segundo compuesto precursor y/o una tercera abertura de entrada (18) en un segmento entre la abertura de entrada (2) y el equipo de fijación (7) , que está unida con el equipo dosificador (15) intercalado con un segundo depósito (19) para alojar un primer o segundo compuesto precursor.

30. Dispositivo según una de las reivindicaciones 20 a 29, caracterizado porque el sensor (22) está unido para transmitir señales de medida con una unidad de control (21) , que está equipada para procesar las señales recibidas del sensor (22) y generar señales de control para el control de equipos dosificadores (15) , láser (8) y/o la posición del espejo (9) y/o de una válvula (15) en la tubería de retorno (23) y está unido con la misma para la transmisión de señales de control.