Procedimiento para la detección simultánea de antígenos de HIV y anticuerpos de HIV.

La invención se refiere a un procedimiento para la diagnosis de una infección por HIV por medio de un inmunoensayo que detecta específicamente el antígeno p24 del antígeno HIV,

HIV1-subO y/o el antígeno p26 del antígeno HIV2, al menos un anticuerpo contra la zona env del HIV1, HIV1-subO y/o HIV2 y al menos un anticuerpo contra la zona pol y/o gag del HIV1, HIV1-subO y/o HIV2. La invención se refiere además a equipos de reactivos y a tiras de prueba adecuadas para el procedimiento de diagnosis y a los anticuerpos monoclonales contra p24 y la utilización de los mismos.

Procedimiento para la detección simultánea de antígenos de HIV y anticuerpos de HIV

El invento se refiere a un procedimiento para el diagnóstico de una infección causada por un HIV (virus de la inmunodeficiencia humana) mediante un ensayo inmunológico por la detección específica de antígenos de HIV y anticuerpos de HIV.

El SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida) es una enfermedad de debilidad inmunitaria heredada, que es causada por el virus HIV. Hasta ahora se conocen como agentes patógenos las cepas HIV1 y HIV2. Ambas cepas se asemejan, en lo que se refiere a la morfología, al tropismo celular, a la interacción con el receptor de CD4 de células T, al efecto citopático in vitro sobre células CD4, a la estructura genómica general, y a la capacidad de provocar la enfermedad del SIDA (Clavel, 1987, AIDS 1, 135-140) . No obstante, el grado de afinidad inmunológica es pequeño, por lo que los anticuerpos específicos para un HIV1 no muestran por lo general ninguna reacción cruzada con un HIV2. Junto a los subtipos más propagados del grupo M de HIV1, se conoce todavía otro subtipo de HIV1, el subtipo O (SubO) (Myers y colaboradores, Banco de Datos de Los Álamos, 1994; Sharp y colaboradores, AIDS suplemento 8, páginas S27-S42, 1994) . El grado de afinidad entre el HIV1-SubO y un HIV1 es esencialmente mayor que entre el HIV1-SubO y un HIV2. No obstante, los anticuerpos, que están dirigidos contra un HIV1 reaccionan de modo cruzado solamente en parte con el correspondiente antígeno del HIV1-SubO. También, una gran parte de los anticuerpos específicos para el HIV1-SubO no reacciona con los antígenos del grupo M de HIV1.

La evolución de una infección por HIV se puede clasificar en varias fases relevantes para el diagnóstico. En la fase temprana de la infección ya se pueden detectar antígenos de HIV, pero todavía no se pueden detectar anticuerpos de HIV. En la fase de la seroconversión, los antígenos de HIV pueden ser detectados de un modo débilmente positivo o negativo, es decir pueden no ser detectables. Los anticuerpos de HIV de la clase IgM son detectables en esta fase. Por el contrario, los anticuerpos de HIV de la clase IgG no son positivos o son sólo débilmente positivos. En la siguiente fase, sin síntomas, se pueden detectar principalmente anticuerpos de HIV del tipo IgG, mientras que no aparece por regla general ningún antígeno de HIV. Lo mismo es válido para la evolución progresiva de la enfermedad en la fase clínica.

En la fase tardía de la enfermedad, finalmente, los anticuerpos de HIV se pueden hacer débilmente positivos o negativos, mientras que los antígenos de HIV, o bien permanecen negativos o por causa de la pérdida de carga con virus, cuando se desmorona el sistema inmunitario del paciente, se pueden detectar de nuevo como positivo. En estas diferentes fases de la enfermedad, cuyas evoluciones pueden diferenciarse en gran manera dependiendo de cada paciente, sigue habiendo por consiguiente siempre momentos, en los que las detecciones, ya sea de antígenos o de anticuerpos, pueden proporcionar valores falsamente negativos.

Para la detección de infecciones con HIV1, HIV2 ó HIV1-SubO se llevan a realización con frecuencia sistemas de ensayo en cuanto a anticuerpos (IgG e IgM) en el formato de un sistema de ensayo de puente, que se describe por ejemplo en el documento de solicitud de patente europea EP-A-0.280.211. Como antígenos se emplean para ello por lo general los antígenos de la denominada región de envoltura (env) , esto es los gp160, gp120, gp41 para los HIV1 y HIV1-SubO y los gp140, gp110, gp36 para los HIV2, conjuntamente con el antígeno p24 (de HIV1) , a base del que está constituido el núcleo del virus, o respectivamente el p26 (de HIV2) . Los antígenos p24 y p26, respectivamente, son codificados por la determinada región gag. Estos sistemas de ensayo proporcionan entonces una señal positiva cuando en la muestra están presentes anticuerpos contra los mencionados antígenos. En las fases temprana y tardía de la enfermedad, cuando está presente un antígeno p24 ó p26 libre, sucede con frecuencia que no se pueden detectar anticuerpos algunos, puesto que o bien el sistema inmunitario del paciente todavía no ha formado suficiente cantidad de anticuerpos, o se ha agotado de tal manera que ya no se forman suficientes anticuerpos para poder detectar a éstos.

Los sistemas de ensayo para determinar antígenos para la detección de un antígeno p24 se llevan a cabo por lo general de manera separada con respecto de los sistemas de ensayo para determinar anticuerpos. Solamente en la fase temprana de la infección y en la fase final del SIDA ha aumentado el título de antígenos en el paciente, de manera tal que solamente en estas fases se puede detectar con seguridad el p24.

Una desventaja de los sistemas de ensayo hasta ahora conocidos consiste en que ninguno de los sistemas de ensayo, considerado por sí solo, cubre todo el período de tiempo de una infección por un HIV, que es relevante para el diagnóstico.

Con ayuda de sistemas combinados de ensayo (Kombitests) se pueden detectar antígenos de un determinado patógeno y anticuerpos contra el mismo patógeno. Un procedimiento de este tipo para la determinación simultánea de antígenos y anticuerpos se divulga en el documento de solicitud de patente alemana DE 42 36 189 A1. No se describe sin embargo un enfoque de solución para abarcar por diagnóstico, sin omisiones, todas las fases de una infección de HIV.

En el documento de solicitud de patente internacional WO 93/21346 se describe un sistema combinado de ensayo para la detección simultánea del antígeno p24 de HIV, y de los anticuerpos gp41 de HIV1 y gp36 de HIV2 (en ambos casos, anticuerpos contra proteínas del gen de env) mediante un ensayo inmunológico heterogéneo. Con este sistema de ensayo, sin embargo, muestras positivas en cuanto a HIV, que no contienen ningún p24 o ningún anticuerpo contra las proteínas env, no son abarcadas como positivas. Solamente con el gp41 no se pueden reconocer todas las muestras de HIV1 que son positivas en cuanto a anticuerpos, puesto que están ampliamente propagadas las muestras, que están caracterizadas porque ellas en la transferencia de borrón Western presentan solamente un incompleto diseño o modelo de bandas y no muestran ninguna coloración de la banda de gp41.

Hashida y colaboradores (1996, J. Clin. Lab. Anal. 10, 213-219) describen un sistema de ensayo de diagnóstico para la detección de infecciones causadas por un HIV1. En este sistema de ensayo se detectan al mismo tiempo el antígeno p24, anticuerpos IgG contra p17 (procedentes de la región gag) y anticuerpos IgG contra la transcriptasa inversa (RT, de Reverse Transcriptase) , que es codificada por el gen pol. Con esta realización del sistema de ensayo es posible sin embargo solamente la detección de infecciones causadas por el HIV1. Además, no se abarcan sueros de seroconversión, que solamente contienen anticuerpos IgM débilmente afines contra los dos antígenos arriba utilizados. Además de ello, no se abarcan sueros de seroconversión, que contienen anticuerpos contra las proteínas de env. Después de la disminución del título de antígenos de HIV en la fase temprana de la infección, aparecen con frecuencia solamente anticuerpos IgM contra la proteína de env gp41. En este caso, el sistema de ensayo de Hashida y colaboradores muestra un resultado falsamente negativo.

En el estado de la técnica no existe hasta el momento actual ningún sistema de ensayo de diagnóstico, con el que sea posible de una manera confiable la detección simultánea de HIV1, HIV1-SubO y HIV2 sin omisiones para todos los estadios de una infección.

Por lo tanto, era una misión la de desarrollar un sistema mejorado de ensayo en cuanto a infecciones causadas por los HIV, que haga posible detectar de manera correcta, confiable y sin omisiones como un sistema de ensayo único todas las fases abarcables por diagnóstico de una infección causada por los HIV. El sistema de ensayo debería hacer posible la determinación simultánea de los HIV1, HIV1-SubO y HIV2.

El problema planteado por esta misión se resuelve mediante el procedimiento conforme al invento para el diagnóstico de una infección causada por los HIV, mediante un ensayo inmunológico por la detección específica del antígeno p-24 de HIV1, HIV1-SubO y/o del antígeno p26 de HIV2, por lo menos de un anticuerpo contra la región env de HIV1, HIV1-SubO y/o HIV2 y por lo menos de un anticuerpo contra las regiones pol y/o gag de HIV1, HIV1-SubO y/o HIV2, realizándose que la región gag no abarca secuencias de los p24/p26 y efectuándose de una manera simultánea la determinación de los antígenos de HIV y de los anticuerpos de HIV individuales como un único sistema... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para el diagnóstico de una infección causada por los HIV mediante un ensayo inmunológico por la detección específica de un antígeno p24 de HIV1, HIV1-SubO y/o de un antígeno p26 de HIV2, por lo menos un anticuerpo contra la región env de HIV1, HIV1-SubO y/o HIV2, y por lo menos un anticuerpo contra las regiones pol y/o gag procedentes de HIV1, HIV1-SubO y/o HIV2, no abarcando la región gag secuencias de p24/p26, y efectuándose de una manera simultánea la determinación de los antígenos de HIV y de los anticuerpos de HIV individuales como un único sistema de ensayo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la detección de la infección causada por los HIV se efectúa mediante un ensayo inmunológico heterogéneo.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,

caracterizado porque para la detección se emplean por lo menos un receptor R1, que es capaz de fijarse específicamente con el antígeno p24 de HIV1, HIV1-SubO y/o con el antígeno p26 de HIV2 y que está fijado o puede fijarse a una fase sólida,

por lo menos un receptor R2, que es capaz de fijarse específicamente con el antígeno p24 de HIV1, HIV1-SubO y/o con el antígeno p26 de HIV2 y que lleva una marcación, siendo diferentes los epítopos reconocidos por R1 y R2,

por lo menos un receptor R3, que es capaz de fijarse específicamente con el anticuerpo que se ha de determinar, dirigido contra un antígeno procedente de la región env de HIV1, HIV1-SubO y/o HIV2, y que está fijado o puede fijarse a una fase sólida,

por lo menos un receptor R4, que es capaz de fijarse específicamente con el anticuerpo que se ha de determinar, dirigido contra un antígeno procedente de la región env de HIV1, HIV1-SubO y/o HIV2, y que lleva una marcación,

por lo menos un receptor R5, que es capaz de fijarse específicamente con el anticuerpo que se ha de determinar, dirigido contra un antígeno procedente de la región pol ó gag de HIV1, HIV1-SubO y/o HIV2, y que está fijado o puede fijarse a una fase sólida,

por lo menos un receptor R6, que es capaz de fijarse específicamente con el anticuerpo que se ha de determinar, dirigido contra un antígeno procedente de la región pol ó gag de HIV1, HIV1-SubO y/o HIV2, y que lleva una marcación, eventualmente una separación de la fase sólida con respecto de la fase líquida y una determinación de la marcación en una de las dos fases.

4. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3,

caracterizado porque los receptores R1 y R2 son capaces de fijarse específicamente con el antígeno p24 de HIV1, los receptores R3 y R4 son capaces de fijarse específicamente con el anticuerpo de HIV1 que se ha de determinar, dirigido contra un antígeno procedente de la región env, y los receptores R5 y R6 son capaces de fijarse específicamente con el anticuerpo de HIV1 que se ha de determinar, dirigido contra un antígeno procedente de la región gag ó pol.

5. Procedimiento según la reivindicación 3 ó 4, caracterizado porque los receptores R5 y R6 son capaces de fijarse específicamente con el anticuerpo de HIV1 que se ha de determinar,

dirigido contra un antígeno procedente de la región pol.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque los receptores R5 y R6 son capaces de fijarse específicamente con anticuerpos dirigidos contra la transcriptasa inversa

de un HIV.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque los receptores R5 y R6 son capaces de fijarse específicamente con anticuerpos dirigidos contra el antígeno p17 de gag.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7,

caracterizado porque también se detecta una infección con el subtipo O de HIV1.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8,

caracterizado porque también se detecta una infección con todos los subtipos del grupo M de HIV1.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9,

caracterizado porque los receptores R1 y R2 son en cada caso mezclas de diferentes receptores, que reconocen a diferentes epítopos del antígeno p24 de HIV1, HIV1-SubO y/o diferentes epítopos del antígeno p26 de HIV2.

11. Utilización de un anticuerpo monoclonal contra el antígeno p24 de HIV1, que se fijan específicamente a los epítopos de p24 de acuerdo con SEQ ID NO: 3, 9, 17, 31 ó 34, en un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Anticuerpos monoclonales contra el antígeno p24 de HIV1, que son producidos por los linajes celulares MAK<p24>M-6A9/5 (número de depósito DSM ACC2310) , MAK<p24>M-4B1/1 (número de depósito DSM ACC2299) , MAK<p24>M-6D9/4 (número de depósito DSM ACC2300) o MAK<p24>M-2E7/3 (número de depósito DSM ACC2301) .

13. Utilización de anticuerpos monoclonales contra el antígeno p24 de HIV1, que se fijan a p24 de manera equivalente a como lo hacen los anticuerpos monoclonales, que son producidos por los linajes celulares MAK<p24>M6A9/5 (número de depósito DSM ACC2310) , MAK<p24>M-4B1/1 (número de depósito DSM ACC2299) , MAK<p24>M6D9/4 (número de depósito DSM ACC2300) o MAK<p24>M-2E7/3 (número de depósito DSM ACC2301) , en un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10.

14. Utilización de anticuerpos monoclonales contra el antígeno p24 de HIV1, que se fijan a los mismos epítopos que los anticuerpos monoclonales, que son producidos por los linajes celulares MAK<p24>M-6A9/5 (número de depósito DSM ACC2310) , MAK<p24>M-4B1/1 (número de depósito DSM ACC2299) , MAK<p24>M-6D9/4 (número de depósito DSM ACC2300) o MAK<p24>M-2E7/3 (número de depósito DSM ACC2301) , en un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10.

15. Utilización de por lo menos un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 12 en un sistema de ensayo de diagnóstico para la detección de una infección causada por los HIV.

16. Utilización de por lo menos un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 12 en un sistema de ensayo de diagnóstico en un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 10 para la detección de una infección causada por los HIV.

17. Estuche de reactivos para la detección de una infección causada por HIV, que contiene por lo menos un receptor R1, que es capaz de fijarse específicamente con el antígeno p24 de HIV1, HIV1-SubO y/o con el antígeno p26 de HIV2 y que está fijado o puede fijarse a una fase sólida,

por lo menos un receptor R2, que es capaz de fijarse específicamente con el antígeno p24 de HIV1, HIV1-SubO y/o con el antígeno p26 de HIV2 y que lleva una marcación, siendo diferentes los epítopos reconocidos por R1 y R2,

por lo menos un receptor R3, que es capaz de fijarse específicamente con el anticuerpo que se ha de determinar, dirigido contra un antígeno procedente de la región env de HIV1, HIV1-SubO y/o HIV2 y que está fijado o puede fijarse a una fase sólida,

por lo menos un receptor R4, que es capaz de fijarse específicamente con el anticuerpo que se ha de determinar, dirigido contra un antígeno procedente de la región env de HIV1, HIV1-SubO y/o HIV2 y que lleva una marcación,

por lo menos un receptor R5, que es capaz de fijarse específicamente con el anticuerpo que se ha de determinar, dirigido contra un antígeno procedente de las regiones pol ó gag de HIV1, HIV1-SubO y/o HIV2 y que está fijado o puede fijarse a una fase sólida,

por lo menos un receptor R6, que es capaz de fijarse específicamente con el anticuerpo que se ha de determinar, dirigido contra un antígeno procedente de las regiones pol ó gag de HIV1, HIV1-SubO y/o HIV2 y que lleva una marcación, así como eventualmente otros materiales auxiliares usuales, no abarcando la región gag secuencias de p24/p26.

18. Estuche de reactivos según la reivindicación 17, caracterizado porque como receptores R1 y R2 se emplean los anticuerpos que son producidos por los linajes celulares MAK<p24>M-6A9/5 (número de depósito DSM ACC2310) , MAK<p24>M-4B1/1 (número de depósito DSM ACC2299) , MAK<p24>M-6D9/4 (número de depósito DSM ACC2300) o MAK<p24>M-2E7/3 (número de depósito DSM ACC2301) .

19. Tira de ensayo, que contiene por lo menos un receptor R1, que es capaz de fijarse específicamente con el antígeno p24 de HIV1, HIV1-SubO y/o con el antígeno p26 de HIV2 y que está fijado o puede fijarse a una fase sólida,

por lo menos un receptor R2, que es capaz de fijarse específicamente con el antígeno p24 de HIV1, HIV1-SubO y/o con el antígeno p26 de HIV2 y que lleva una marcación, siendo diferentes los epítopos reconocidos por R1 y R2,

por lo menos un receptor R3, que es capaz de fijarse específicamente con el anticuerpo que se ha de determinar, dirigido contra un antígeno procedente de la región env de HIV1, HIV1-SubO y/o HIV2 y que está fijado o puede fijarse a una fase sólida,

por lo menos un receptor R4, que es capaz de fijarse específicamente con el anticuerpo que se ha de determinar, dirigido contra un antígeno procedente de la región env de HIV1, HIV1-SubO y/o HIV2 y que lleva una marcación,

por lo menos un receptor R5, que es capaz de fijarse específicamente con el anticuerpo que se ha de determinar, dirigido contra un antígeno procedente de las regiones pol ó gag de HIV1, HIV1-SubO y/o HIV2, y que está fijado o puede fijarse a una fase sólida,

por lo menos un receptor R6, que es capaz de fijarse específicamente con el anticuerpo que se ha de determinar, dirigido contra un antígeno procedente de las regiones pol ó gag de HIV1 y/o HIV2 y que lleva una marcación, así como eventualmente otros materiales auxiliares usuales, no abarcando la región gag secuencias de p24/p26.