Procedimiento de detección de la expresión de una proteína de cubierta de un retrovirus endógeno humano y utilizaciones de un gen que codifica para esta proteína.

Utilización de un fragmento de ácido nucleico que codifica para la expresión de un péptido de una proteína decubierta del retrovirus endógeno humano HERV-W,

empezando dicho péptido en el aminoácido 448 y terminando enel aminoácido 538 de SEC ID no 1, para preparar una composición de terapia génica, destinada al tratamiento decánceres por destrucción de las células indicadoras cancerígenas que expresan el receptor hATBo, por medio de laformación de sincitios.

Procedimiento de detección de la expresión de una proteína de cubierta de un retrovirus endógeno humano y utilizaciones de un gen que codifica para esta proteína.

Los retrovirus son unos virus revestidos que llevan unas espículas glicoproteicas codificadas por los virus en su superficie. Estas glicoproteínas de cubierta son sintetizadas en forma de precursores poliproteicos (pre-env) que son después escindidos por unas proteasas celulares en proteína de superficie madura (SU) y en proteína transmembranaria (TM) . Las glicoproteínas de cubierta están implicadas en la entrada de los virus en las células hospedantes. Estas reconocen específicamente y se unen a unos receptores de superficie celular y son necesarias para la fusión de la cubierta viral y de las membranas celulares del hospedante. El receptor y la cubierta son unas moléculas multiméricas u oligoméricas. Para todos los virus revestidos, las interacciones de las glicoproteínas de cubierta con el o los receptores celulares conducen a reorganizaciones conformacionales de la cubierta necesarias a la exposición del péptido de fusión. La fusión tiene lugar en la superficie de la célula o en unas vesículas celulares según la vía de endocitosis del virión. Además, para permitir la entrada del virus, una fusión mediada por las proteínas de superficie virales puede, en algunas condiciones, provocar una fusión célula a célula con, como resultado, la formación de células multinucleadas gigantes o sincitios. La formación de sincitios se realiza por lo menos por dos vías: un virión puede simultáneamente fusionarse con dos células, se habla entonces de fusión "from without", o una célula infectada que expresa las glicoproteínas de cubierta a su superficie puede fusionarse con una célula adyacente (fusión "from within") .

Los determinantes de la cubierta y la secuencia de los eventos que causan los cambios de conformación de la cubierta durante unos procesos de fusión "from without" son bien documentos para los ortomixovirus que necesitan un entorno ácido de las vesículas de endocitosis para su entrada (Skehel, J. J. et al., PNAS, 79:968-972 (1982) ) . Para los retrovirus, para los cuales la vía de entrada es independiente del pH, los determinantes precisos y las etapas, que llevan del reconocimiento del receptor a la activación de la fusión no están aún elucidados. Otros retrovirus son conocidos por inducir una fusión célula a célula ("fusion from within") , tales como el virus de la leucemia felina, el virus del tumor de mama del ratón, el virus de la reticuloendoteliosis aviaria, VIH y SIV.

Por otra parte, Fefferey S. Jones y Rex Risser (Journal of Virology, Janv. 1993, p 67-74) han mostrado que las glicoproteínas de cubierta del virus de la leucemia murina ecotrópica (MuLV) de tipo salvaje, bajo la dependencia del LTR viral, eran capaces de inducir la formación de sincitios en células de rata XC en ausencia de virión (fusión "from within") .

Según les consta a los inventores, no se ha demostrado jamás un poder fusógeno en un proceso de fusión "from within", de las glicoproteínas de cubierta de un retrovirus endógeno humano.

Algunos autores han emitido la hipótesis que la cubierta retroviral endógena de ERV3, un retrovirus endógeno humano próximo de MLV (Moloney Leukemia Virus) , podría estar implicado in vivo en la elaboración de la placenta a través de un proceso de fusión (Patrick J. W. Venables et al., Virology, 211, 589-592 (1995) ) , pero este fenómeno no se ha demostrado jamás in vivo. Por otra parte, los estudios sobre el polimorfismo de env ERV3, sobre unos individuos de origen caucásico, han permitido poner en evidencia la presencia de una mutación en la región (SU) de la cubierta ERV3 que genera un codón de terminación precoz presente en el estado homocigoto en el 1% de la población estudiada, sin que estos individuos presenten ninguna anomalía del embarazo o del desarrollo placentario (Nathalie de Parseval y Thierr y Heidmann, Journal of Virology, Vol. 72, N° 4, páginas 3442-3445 (1998) ) , poniendo así en duda la hipótesis anteriormente emitida.

Los presentes inventores han puesto en evidencia ahora in vitro que la glicoproteína de cubierta de HER-W no modificada, expresada bajo la dependencia de un promotor, preferentemente un promotor heterólogo, posee unas propiedades fusógenas.

HERV-W es una familia de retrovirus endógenos humanos multi-copia recientemente descrita, denominada así debido a la homología entre el sitio de fijación del cebador de la transcripción y el de los retrovirus aviarios que utilizan el ARNt Trp. No se ha demostrado ninguna entidad competente para su replicación. Se ha verificado la funcionalidad de una región promotora y, entre diferentes tejidos humanos sanos ensayados, su expresión parece estar restringida a la placenta por transferencia Northern (J. L Blond et al., Journal of Virology, Vol. 73, N° 2, páginas 1175-1185 (1999) ) . Un cuadro abierto de lectura único que codifica para una cubierta retroviral potencialmente funcional existe en el cromosoma 7. Un clon ADNc que corresponde aparentemente a un transcrito sub-genómico y que tiene la secuencia de la cubierta completa se ha aislado a partir de material placentario (clon cl.PH74, GenBank AF072506, cuya secuencia está identificada por SEC ID No 2) . Los estudios filogenéticos efectuados a nivel proteico indican que la proteína de cubierta es de tipo D. La secuencia SEC ID no 2 dada al final de la descripción corresponde por lo tanto a la secuencia nucleotídica en ADNc completa del clon cl.PH74 cuya secuencia proteica está identificada por SEC ID no 1.

Env HERV-W posee todos los "atributos" de una cubierta retroviral: en particular, un péptido líder, las dos subunidades características SU y TM separadas por un sitio de escisión por las furinas y a nivel de su TM posee un péptido de fusión hidrófobo, una región inmunosupresora y una región carboxilo transmembranaria seguida de una cola citoplásmica larga. La expresión de Env HERV-W se ha demostrado en la placenta.

Los experimentos realizados por los inventores muestran que Env HERV-W conlleva, por fusión de célula a célula, la formación de sincitios en diferentes líneas celulares ensayadas de origen humano y del simio. El fenómeno de fusión observado es dependiente del reconocimiento de receptor (es) específico (s) , como se muestra de manera directa durante las transfecciones y de manera indirecta durante los co-cultivos de las células transfectadas con otros tipos celulares. Los presentes inventores han identificado por otra parte el receptor específico de Env HERV-W por un enfoque de competición que se basa en la propiedad de interferencia de las cubiertas retroviales, bloqueando unos receptores celulares por una proteína de cubierta diferente de Env HERV-W, impidiendo así la formación de sincitios. El receptor identificado por los presentes inventores es el receptor hATBo de los retrovirus de mamíferos de tipo D expresado en las células humanas (Rasko E. J. et al. PNAS, 1999, 96: 2129-2134 y Tailor C. S. et al. J. Virol., 1999, 73 (5) : 4470-4474) .

Los inventores han realizado un procedimiento de detección de la expresión de una proteína o de un polipéptido de un retrovirus endógeno humano, según el cual la proteína o el polipéptido presenta una secuencia polipeptídica que comprende la secuencia SEC ID no 1, o un fragmento de SEC ID no 1, o una secuencia que presenta, para cada serie de 20 aminoácidos, por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90% o también por lo menos 95% de identidad con la secuencia SEC ID no 1 o con un fragmento de SEC ID no 1, y según el cual se detecta el poder fusógeno de dicha proteína o dicho fragmento en unas células de un tejido celular o de un cultivo celular, mediante la demostración de la formación de sincitios.

También ha realizado un procedimiento de detección de la expresión de una proteína o de un polipéptido de cubierta de un retrovirus endógeno humano, según el cual la proteína o el péptido presenta una secuencia polipeptídica que presenta, para cada serie de 20 aminoácidos, por lo menos el 80%, preferentemente por lo menos el 90% o también por lo menos el 95% de identidad con la secuencia SEC ID no 1, y según el cual se detecta el poder fusógeno de dicha proteína en unas células de un tejido celular, o de un cultivo celular por la demostración de la formación de sincitios.

Dicha proteína o dicho polipéptido presenta una secuencia polipeptídica que comprende la secuencia SEC ID no 1 o un fragmento de SEC ID no 1, o una secuencia que presenta, para cada serie de 20 aminoácidos, por lo menos el 90%, preferentemente por lo menos el 90%, o también por lo menos el 95%, de identidad con la secuencia SEC ID no 1... [Seguir leyendo]

1. Utilización de un fragmento de ácido nucleico que codifica para la expresión de un péptido de una proteína de cubierta del retrovirus endógeno humano HERV-W, empezando dicho péptido en el aminoácido 448 y terminando en el aminoácido 538 de SEC ID no 1, para preparar una composición de terapia génica, destinada al tratamiento de cánceres por destrucción de las células indicadoras cancerígenas que expresan el receptor hATBo, por medio de la formación de sincitios.

2. Utilización de un gen que codifica para la expresión de una proteína de cubierta del retrovirus endógeno humano HERV-W, comprendiendo dicha proteína, o consistiendo en, la SEC ID no 1, para preparar una composición de terapia génica, destinada al tratamiento de cánceres por destrucción de las células indicadoras cancerígenas que expresan el receptor hATBo, por medio de la formación de sincitios.

3. Utilización según la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque la composición comprende un promotor heterólogo 15 o autólogo, preferentemente heterólogo, para la expresión de dicho péptido o de dicha proteína.

4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la composición comprende un vector de terapia génica que comprende dicho péptido o dicha proteína.

5. Utilización según la reivindicación 4, caracterizada porque el vector se selecciona de entre un vector retroviral de tipo MLV, un vector lentiviral pseudotipados por dicha proteína, un vector sintético.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque las células cancerígenas son destruidas por formación de sincitios entre unas células transformadas por dicho vector y dichas células 25 cancerígenas.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque las células cancerígenas son trasformadas por dicho vector.