Un procedimiento para purificar una proteína que comprende mezclar una preparación que contiene la proteína con una disolución formada por una combinación de una primera sal y una segunda sal,

cargar la mezcla en una columna de cromatografía de interacciones hidrófobas, y eluir la columna, en el que la primera y la segunda sales tienen diferentes valores liótropos, en el que al menos una sal tiene una capacidad tamponante a un pH al cual es estable la proteína, en el que la concentración de cada una de la primera sal y la segunda sal de la mezcla está entre aproximadamente 0, 1 M y aproximadamente 1, 0 M, y en el que la primera y la segunda sal se eligen de los grupos que consisten en citrato y sulfato, citrato y acetato, citrato y fosfato, acetato y sulfato, y sulfato y fosfato.

Procedimiento de purificación de proteínas Campo de la invención Esta invención se refiere a la purificación de proteínas, y especialmente a un procedimiento de purificación de proteínas usando cromatografía de interacciones hidrófobas.

Antecedentes de la invención

La purificación de proteínas para la producción de productos biológicos o farmacéuticos a partir de diversos materiales de origen implica varios procedimientos. Las proteínas terapéuticas pueden obtenerse a partir de extractos plasmáticos o tisulares, por ejemplo, o pueden producirse mediante cultivos celulares o usando células eucariotas o procariotas que contienen al menos un plásmido recombinante que codifica para la proteína deseada. Entonces las proteínas modificadas genéticamente son, bien secretadas en el medio circundante o en el espacio perinuclear, o bien creadas intracelularmente y extraídas de las células. Se utilizan varias tecnologías bien conocidas para purificar las proteínas deseadas a partir de su material de origen. Los procedimientos de purificación incluyen procedimientos en los que la proteína de interés se separa de los materiales de origen sobre la base de la solubilidad, la carga iónica, el tamaño molecular, las propiedades de adsorción y la unión específica a otras moléculas. Los procedimientos incluyen cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y cromatografía de interacciones hidrófobas.

La cromatografía de interacciones hidrófobas (CIH) se usa para separar proteínas sobre la base de interacciones hidrófobas entre las fracciones hidrófobas de la proteína y grupos hidrófobos insolubles inmovilizados en la matriz. Generalmente, la preparación proteica en un tampón altamente salino se carga en la columna de CIH. La sal del tampón interactúa con las moléculas de agua para reducir la solvatación de las proteínas en disolución, exponiendo así las regiones hidrófobas de la proteína, que entonces son adsorbidas por grupos hidrófobos de la matriz. Cuanto más hidrófoba es la molécula, menor es la sal requerida para promover la unión. Habitualmente se usa un gradiente salino decreciente para eluir las proteínas desde una columna. Según disminuye la fuerza iónica, la exposición de las regiones hidrófilas de la proteína aumenta, y las proteínas se diluyen desde la columna en creciente orden de hidrofobicidad. Véase, por ejemplo Protein Purification, 2ª Ed., Springer-Verlag, Nueva York, 176-179 (1988) . El documento US 5.231.171 (Holtz y col.) describe la purificación de la proteína IGF-1, mediante el uso de una columna cromatográfica de interacciones hidrófobas, el documento US 5.928.915 (Sliwkowski y col.) describe el uso de sulfato amónico 2 M en combinación con un tampón de fosfato en una columna cromatográfica de interacciones hidrófobas para purificar la proteína sialidasa de células CHO, y el documento US 5.395.856 (Haase) describe una columna de afinidad de avidina.

Cuando se desarrollan procedimientos para la producción comercial de proteínas terapéuticamente importantes, es altamente deseable aumentar la eficacia de cualquier etapa de purificación intermedia. Una forma de mejorar la facilidad y la eficacia de elaboración es aumentar la capacidad de carga de una o más de las etapas intermedias del procedimiento de purificación, hasta el punto de reducir el número de ciclos requeridos para purificar un lote de proteínas sin comprometer la calidad de la separación de las proteínas. La presente invención mejora el procedimiento de purificación de proteínas aumentando la capacidad y la eficacia de una etapa intermedia.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para purificar una proteína que comprende mezclar una preparación proteica con una disolución que contiene una primera sal y una segunda sal, formando una mezcla que se carga en una columna cromatográfica de interacciones hidrófobas, y eluyendo la columna, en el que la primera y la segunda sales tienen diferentes valores liótropos, y al menos una sal tiene capacidad tamponante a un pH al cual es estable la proteína, en el que la concentración de cada una de la primera sal y la segunda sal en la mezcla está entre aproximadamente 0, 1 M y aproximadamente 1, 0 M, y en el que la primera y la segunda sal se eligen de los grupos formados por citrato y sulfato, citrato y acetato, citrato y fosfato, acetato y sulfato, y sulfato y fosfato. En una forma de realización, el pH de la mezcla y el tampón de equilibrio está entre aproximadamente pH 5 y aproximadamente pH 7. El procedimiento comprende adicionalmente eluir la proteína.

La presente invención proporciona combinaciones de sales útiles para aumentar la capacidad dinámica de una columna de CIH en comparación con la capacidad dinámica de la columna usando sales separadas solas. Estas combinaciones de sales permiten disminuir la concentración de al menos una de las sales para conseguir una mayor capacidad dinámica, sin comprometer la calidad de la separación de las proteínas. La primera y la segunda combinación de sales se eligen para cada proteína en particular mediante un procedimiento que establece las curvas de precipitación para cada sal individualmente, y las curvas de precipitación para la combinación de sales manteniendo una sal constante y variando la segunda. Las concentraciones de las combinaciones salinas pueden optimizarse adicionalmente, por ejemplo, para asegurar la estabilidad proteica a la temperatura ambiente y para evitar la formación de agregados en la preparación.

Las primeras sales preferidas son aquellas que forman tampones eficaces a un pH al cual es estable la proteína. La primera y la segunda sal se eligen entre acetato, citrato, fosfato, sulfato o cualquier sal mineral o de un ácido orgánico de las mismas. En una forma de realización, el pH de la mezcla está entre aproximadamente pH 5 y aproximadamente pH 7. Las concentraciones salinas finales de la primera sal y de la segunda sal en la mezcla están cada una entre aproximadamente 0, 1 M y 1, 0 M, en otra forma de realización entre aproximadamente 0, 3 M y aproximadamente 0, 7 M. Los cationes pueden elegirse de entre cualquier catión no tóxico, incluyendo NH4+, K+ y Na+. Los cationes preferidos son aquellos que no tienden a desnaturalizar la proteína o a provocar la precipitación en combinación con otros iones, incluyendo NH4+ yNa+.

La columna puede eluirse con una disolución con un pH de entre aproximadamente pH5 y aproximadamente pH7. Las sales pueden elegirse de entre sales de sodio, de amonio y de potasio, y son preferiblemente sales sódicas. La proteína puede ser una proteína de fusión o un anticuerpo, tal como una proteína de fusión Fc o un anticuerpo monoclonal. El procedimiento puede incluir diluir la proteína, filtrar la proteína, formular la proteína y/o liofilizar la proteína.

Los dos tampones salinos de la presente invención dan como resultado un aumento en la capacidad dinámica de una columna de CIH para una proteína en particular en comparación con la capacidad dinámica conseguida por sales individuales. Esto da como resultado una disminución del número de ciclos requerido para purificar un lote de proteínas. Por lo tanto, la presente invención tiene una aplicabilidad especial en las prácticas de elaboración comerciales para elaborar y purificar proteínas comercialmente importantes.

Breve descripción de las figuras La Figura 1 muestra curvas de precipitación salina dobles para un anticuerpo frente al EGFR realizadas según se describe en el Ejemplo I, a continuación. La Figura 1A muestra la curva de precipitación para sulfato sódico 0, 5 M con concentraciones crecientes de fosfato sódico, y la curva de precipitación para fosfato sódico 0, 4 M con concentraciones crecientes de sulfato sódico. La Figura 1B muestra las curvas de precipitación para citrato sódico 0, 55 M con concentraciones crecientes de fosfato sódico, y fosfato sódico 0, 4 M con concentraciones crecientes de citrato sódico. La Figura 1C muestra las curvas de precipitación para acetato sódico 0, 6 M con concentraciones crecientes de sulfato sódico, y fosfato sódico 0, 5 M con concentraciones crecientes de sulfato sódico. La Figura 1D muestra las curvas de precipitación para acetato sódico 0, 6 M con concentraciones crecientes de citrato sódico, y citrato sódico 0, 55 M con concentraciones crecientes de acetato sódico. La Figura IE muestra las curvas de precipitación para citrato sódico 0, 55 M con concentraciones crecientes de sulfato sódico, y sulfato sódico 0, 5 M con concentraciones crecientes de citrato sódico.... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para purificar una proteína que comprende mezclar una preparación que contiene la proteína con una disolución formada por una combinación de una primera sal y una segunda sal, cargar la mezcla en una columna de cromatografía de interacciones hidrófobas, y eluir la columna, en el que la primera y la segunda sales tienen diferentes valores liótropos, en el que al menos una sal tiene una capacidad tamponante a un pH al cual es estable la proteína, en el que la concentración de cada una de la primera sal y la segunda sal de la mezcla está entre aproximadamente 0, 1 M y aproximadamente 1, 0 M, y en el que la primera y la segunda sal se eligen de los grupos que consisten en citrato y sulfato, citrato y acetato, citrato y fosfato, acetato y sulfato, y sulfato y fosfato.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el pH de la mezcla cargada en la columna está entre 10 aproximadamente pH 5 y aproximadamente pH 7.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la columna se eluye con una disolución con un pH entre aproximadamente pH 5 y aproximadamente pH 7.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que las sales se eligen de entre sales de sodio, sales de amonio y sales de potasio.

15 5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las sales son sales de sodio.

6. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la proteína es una proteína de fusión o un anticuerpo.

7. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la proteína es un anticuerpo monoclonal o una proteína de fusión Fc.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente diluir la proteína.

20 9. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente filtrar la proteína.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente formular la proteína.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente liofilizar la proteína.