Procedimiento de modificar células eucariotas.

Un procedimiento de modificar un locus genico endogeno de la region variable de la inmunoglobulina en unacelula madre embrionaria (ES) de raton aislada mediante sustitucion in situ del locus endogeno con un locus genicohumano ortologo o mediante sustitucion in situ de uno o mas de los segmentos genicos V y J,

o V, D y J del locusendogeno con segmentos genicos V y J, o V, D y J ortologos, en el que dicho procedimiento comprende:

a) obtener un fragmento genomico clonado grande de mas de 20 kb que contiene los segmentos genicoshumanos ortologos V y J o V, D y J;

b) usar la recombinacion homologa bacteriana para modificar geneticamente el fragmento genomico clonado de(a) para crear un vector dirigido para usar en celulas ES de raton (LTVEC);

c) introducir el LTVEC de (b) en una celula ES de raton para sustituir dicho locus genico endogeno deinmunoglobulina o dicho uno o mas segmentos V y J o V, D y J del mismo in situ con el locus genico humanoortologo o los segmentos genicos humanos ortologos V y J o V, D y J; y

d) usar un ensayo cuantitativo para detectar modificacion de alelo (MDA) en la celula ES de raton de (c) paraidentificar una celula ES de raton en la que dicho locus genico endogeno de la region variable de lainmunoglobulina o dicho uno o mas segmentos V y J o V, D y J del mismo se han sustituido in situ con el locusgenico humano ortologo o los segmentos genicos humanos ortologos V y J o V, D y J.

Procedimientos de modificar células eucariotas

Esta solicitud reclama prioridad sobre la solicitud de utilidad de la patente de EE.UU. número de serie 09/784, 859, presentada el 16 de febrero de 2001.

Campo de la invención

El campo de la presente invención es un procedimiento para realizar y usar vectores de ADN grandes mediante recombinación homóloga y modificar, de cualquier modo deseado, los genes endógenos y loci cromosómico en células eucarióticas. Estos grandes vectores dirigidos de ADN para células eucariotas, denominados LYVEC, dervan d efragmentos de ADN genómico clonado más grande que los usados habitualmente por otros abordajes destinados a realizar la dirección homóloga en células eucariotas. El campo de la invención proporciona además un procedimiento rápido y cómodo de detectar células eucariotas en las que el LTVEC ha llegado correctamente y ha modificado los genes endógenos o locu (loci) cromosómicos deseados. El campo también aborda el uso de estas células para generar organismos portadores de la modificación genética, los propios organismos y los procedimientos de uso de los mismos.

Introducción

El uso de LTVEC proporciona ventajas sustanciales sobre los procedimientos actuales. Por ejemplo, dado que derivan de fragmentos de ADN más grandes que los actualmente usados para generar vectores dirigidos, los MTVEC pueden generarse con mayor rapidez y convenientemente a partir de bibiliotecas disponibles de fragmentos grandes de ADN genómico (tales como bibliotecas de BAC y PAC) que los vectores dirigidos fabricados usando las tecnologías actuales. Además, modificaciones más grandes además de modificaciones que abarcan regiones genómicas más grandes se pueden generar más convenientemente que usando las tecnologías actuales. Además, la presente invención aprovecha las regiones de homología largas para incrementar la frecuencia para dirigir a los loci "difíciles de llegar" y, también, disminuye los beneficios, si existen, de usar ADN isogénico en estos vectores dirigidos.

Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento rápido, conveniente y simplificado para modificar sistemáticamente casi todos los genes endógenos y loci cromosómicos de un organismo dado.

Antecedentes de la invención

Se ha demostrado que apuntar a genes por medio de recombinación homóloga entre ADN exógeno homólogo y secuencias cromosómicas endógenas es un modo extremadamente valioso para crear deleciones, inserciones, diseñar mutaciones, corregir mutaciones génicas, introducir transgenes o realizar otras modificaciones genéticas en ratones. Los procedimientos actuales implican el uso de vectores dirigidos estándar, con regiones de homología con ADN endógeno que sunam normalmente menos de 10-20 kn, para introducir la modificación genética deseada en las células madre embrionarias (ES) de ratón, seguiodo de la inyección de las c´leulas ES alteradas en embriones de ratones para transmitir estas modificaciones genéticas de ingeniería en la línea germinal del ratón (Smithies y col., Nature, 317:230-234, 1985; Thomas y col., Cell, 51 :503-512, 1987; Koller y col., Proc Natl Acad Sci USA, 86:89278931, 1989; Kuhn y col., Science, 254:707-710, 1991; Thomas y col., Nature, 346:847-850, 1990; Schwartzberg y col., Science, 246:799-803, 1989; Doetschman y col., Nature, 330:576-578, 1987; Thomson y col., Cell, 5:313-321, 1989; DeChiara y col., Nature, 345:78-80, 1990; patente de EE.UU. nº 5, 789, 215, presentado el 4 de agosto de1998 en representación de GenPharm International) . En estos procedimientos actuales, la detección de las células ES raras en las que los vectores dirigidos estándar se han dirigido correctamente y han modificado los gen (es) endógenos o locus (ci) cromosómicos deseados require información sobre la secuencia fuera de las secuencias homólogas dirigidos contenidas dentro del vector dirigido. Los ensayos para una dirección con éxito implican transferencia Southern estándar o una PCR larga (Cheng, y col., Nature, 369:684-5, 1994; Foord y Rose, PCR Methods Appl, 3:S149-61, 1994; Ponce y Micol, Nucleic Acids Res, 20:623, 1992; patente de EE.UU. nº 5, 436, 149 de Takara Shuzo Co., Ltd.) de las secuencias fuera del vector dirigido y abarcan un brazo de homología completo (véase Definiciones) ; por tanto, dado las grandes consideraciones que limitan estos procedimientos, el tamaño de los brazos de homología está restringido a menos de 10-20 kb en total (Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999) .

Jessen et al (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 95: 5121-5126 (1998) ) divulgan una modificación de cromosomas artificiales bacterianos a través de recombinació homóloga estimulada por Chi y su aplicación en trnasgénesis en el pez cebra. El documento WO 94/02602 divulga la generación de anticuerpos xenogeneicos. Yang y col., Nature Biotechnology,

15: 859-865 (1997) ) divulga modificaciones basadas en recombinación homóloga en Escherichia coli y la transmisión de la línea germinal en ratones transgénicos de un cromosoma artificial de bacteria. Lie y col. (Curr. Opin. Biotech.,

9: 43-48 (1998) ) divulgan avances en la tecnología de PCR cuantitativa y ensayos con 5’-nucleasa. Bruggemann (Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 49: 203-208 (2001) ) divulga la expression de anticuerpos humanos en ratones transgénicos. Bruggemann and Taussig (Curr. Opin. Biotech., 8: 455-458 (1997) ) divulga la

producción de repertorios de anticuerpos humanos en ratones transgénicos.

La capacidad para usar vectores dirigidos como brazos de homología mayores que los usados en los procedimientos actuales sería extremadamente valiosa. Por ejemplo, dichos vectores dirigidos podrían generarse más rápida y convenientemente a partir de las bibliotecas disponibles que contienen insertos genómicos grandes (p. ej., bibliotecas BAC o PAC) que los vectores dirigidos fabricados usando las tecnologías actuales en las que los insertos genómicos tienen que caracterizarse extensamente y recortarse antes de usar. Además, modificaciones más grandes además de modificaciones que abarcan regiones genómicas más grandes se podrían generar más convenientemente y en menos etapas que usando las tecnologías actuales. Además, el uso de regiones largas de homología podría aumentar la frecuencia de dirección de los loci “difíciles de apuntar” en células eucariotas, ya que apuntar a la recombinación homóloga en células eucariotas parece que está relacionada con la homología total contenida en el vector dirigido (Deng y Capecchi, Mol Cell Biol, 12: 3365-71, 1992) . Además, la mayor frecuencia de la dirección obtenida usando brazos largos de homología podría disminuir cualquier posible beneficio que se pueda obtener del uso de ADN isogénico en estos vectores dirigidos.

El problema de las modificaciones precisas mediante ingeniería en fragmentos genómicos muy grandes, como los clonados en las bibliotecas BAC, se ha resuelto en gran medida mediante el uso de recombinación homóloga en bacterias (Zhang, y col., Nat Genet, 20:123-8, 1998; Yang, y col., Nat Biotechnol, 15:859-65, 1997; Angrand, y col., Nucleic Acids Res, 27:e16, 1999; Muyrers, y col., Nucleic Acids Res, 27:1555-7, 1999; Narayanan, y col., Gene Ther, 6:442-7, 1999) , que permite la construcción de vectores que contienen regiones grandes de homología con los genes endógenos o loci cromosómicos eucariotas. No obstante, una vez fabricados, estos vectores no han sido en general útiles para modificar genes endógenos o loci cromosómicos mediante recombinación homóloga por la dificultad en la detección de acontecimientos dirigidos correctos cuando los brazos de homología son más grandes que 10-20 kb (Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999) . En consecuencia, los vectores generados usando recombinación homóloga bacteriana de fragmentos genómicos de BC debe recortarse extensamente antes de usar como vectores dirigidos (Hill y col., Genomics, 64:111-3, 2000) . Por tanto, existe la necesidad de una metodología rápida y conveniente que hace posible el uso de vectores dirigidos que contienen regiones grandes de homología de modo que se modifican los genes endógenos o los loci cromosómicos en células eucariotas.

De acuerdo con la presente invención, los solicitantes proporcionan procedimientos nuevos que permiten el uso de vectores dirigidos que contienen regiones grandes de homología de modo que se modifican los genes endógenos o los loci cromosómicos en células eucariotas mediante recombinación homóloga.... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de modificar un locus génico endógeno de la región variable de la inmunoglobulina en una célula madre embrionaria (ES) de ratón aislada mediante sustitución in situ del locus endógeno con un locus génico humano ortólogo o mediante sustitución in situ de uno o más de los segmentos génicos V y J, o V, D y J del locus endógeno con segmentos génicos V y J, o V, D y J ortólogos, en el que dicho procedimiento comprende:

a) obtener un fragmento genómico clonado grande de más de 20 kb que contiene los segmentos génicos humanos ortólogos V y J o V, D y J; b) usar la recombinación homóloga bacteriana para modificar genéticamente el fragmento genómico clonado de

(a) para crear un vector dirigido para usar en células ES de ratón (LTVEC) ; c) introducir el LTVEC de (b) en una célula ES de ratón para sustituir dicho locus génico endógeno de inmunoglobulina o dicho uno o más segmentos V y J o V, D y J del mismo in situ con el locus génico humano ortólogo o los segmentos génicos humanos ortólogos V y J o V, D y J; y d) usar un ensayo cuantitativo para detectar modificación de alelo (MDA) en la célula ES de ratón de (c) para identificar una célula ES de ratón en la que dicho locus génico endógeno de la región variable de la inmunoglobulina o dicho uno o más segmentos V y J o V, D y J del mismo se han sustituido in situ con el locus génico humano ortólogo o los segmentos génicos humanos ortólogos V y J o V, D y J.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende:

e) obtener un fragmento genómico grande clonado de más de 20 kb que contiene segmentos génicos V y J o V, D y J y que difiere del fragmento de (a) ; f) usar la recombinación homóloga bacteriana para modificar genéticamente el fragmento genómico clonado de

(e) para crear un segundo LTVEC; g) introducir el segundo LTVEC de (f) en la célula ES de ratón identificada en la etapa (d) para sustituir dicho locus génico endógeno variable de inmunoglobulina o dicho uno o más segmentos V y J o V, D y J del mismo in situ con el locus génico humano ortólogo o los segmentos génicos humanos ortólogos V y J o V, D y J; y h) usar un ensayo cuantitativo para detectar modificación de alelo (MDA) en la célula ES de ratón de (g) para identificar una célula ES de ratón en la que dicho locus génico endógeno de la región variable de la inmunoglobulina o dicho uno o más segmentos V y J o V, D y J del mismo se han sustituido in situ con el locus génico humano ortólogo o los segmentos génicos humanos ortólogos V y J o V, D y J.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que las etapas (e) a (h) se repiten hasta que el locus génico endógeno de la región variable de la inmunoglobulina se sustituye totalmente con un locus génico humano ortólogo.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el locus génico variable de la inmunoglobulina es un locus seleccionado del grupo que consiste en:

a) un locus génico variable de la cadena ligera kappa; b) un locus génico variable de la cadena ligera lambda; y c) un locus génico variable de la cadena pesada.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ensayo competitivo comprende PCR cuantitativa, FISH, hibridación genómica comparativa, amplificación de ADN isotérmica o hibridación cuantitativa con una sonda inmovilizada.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la PCR cuantitativa comprende tecnología TaqMan® o PCR cuantitativa usando balizas moleculares.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el LTVEC comprende brazos de homología que totalizan más de 20 kb.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los fragmentos genómicos clonados grandes son de más de 100 kb.

9. Un procedimiento de modificar un locus génico endógeno de la región variable de la inmunoglobulina mediante sustitución in situ del locus endógeno con un locus génico ortólogo o mediante sustitución in situ de uno o más de los segmentos génicos V y J, o V, D y J del locus endógeno con segmentos génicos V y J, o V, D y J ortólogos, en el que dicho procedimiento comprende:

a) crear un LTVEC de más de 20 kb que comprende un sitio de recombinación específico de sitio, un brazo de homología cadena abajo que contiene la región inmediatamente adyacente, pero sin incluir, a los segmentos J del locus génico de la región variable de inmunoglobulina y un brazo de homología cadena arriba dentro del locus génico variable; b) crear un LTVEC de más de 20 kb que comprende un sitio de recombinación específico de sitio, un brazo de

homología cadena arriba que contiene la región adyacente al segmento génico V más distal, pero no contiene ninguno de los segmentos génicos V del locus génico de la región variable de inmunoglobulina y un brazo de homología cadena abajo dentro del locus génico variable; c) introducir los LTVEC de (a) y (b) en la célula ES de ratón; d) usar un ensayo cuantitativo para detectar modificación de alelo (MDA) en el locus génico variable para identificar una célula ES de ratón (c) en las que los sitios de recombinación específicos de sitio flanquean al locus génico de la región variable endógena. e) crear un vector que contiene secuencias de recombinación específicas de sitio que flanquean todo o parte del locus génico ortólogo; y f) introducir el vector de (f) en una célula ES de ratón identificada en la etapa (d) de modo que, mediante recombinación, dicho locus génico endógeno variable de inmunoglobulina o dicho uno o más segmentos V y J o V, D y J del mismo se sustituyen in situ con el locus génico ortólogo y los segmentos génicos V y J o V, D y J humanos.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que los sitios de recombinación específica de sitio se seleccionan de loxP, lox511 y lox2272.

11. El procedimiento de de la reivindicación 9 o 10, en el que dichos LTVEC comprenden brazos de homología que totalizan más de 20 kb.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que dichos LTVEC son de más de 100 kb.

13. Un locus génico de inmunoglobulina híbrida genéticamente modificada obtenible mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

14. Una célula eucariota modificada genéticamente o un ratón que comprende un locus de la región variable de inmunoglobulina modificada genéticamente obtenible mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes in situ en lugar del locus génico endógeno de la región variable de inmunoglobulina.

15. Una célula madre embrionaria de ratón (ES) que contiene un locus génico de la región variable de inmunoglobulina genéticamente modificado obtenible mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 in situ en lugar del locus génico endógeno de la región variable de inmunoglobulina.

16. Una célula ES de ratón de la reivindicación 15, en la que el locus de la región variable de la cadena pesada de ratón o uno o más segmentos génicos V, D y J de los mismos se sustituyen in situ con un locus génico variable de la cadena pesada humana o uno o más segmentos génicos V, D y J de los mismos; o el locus de la región variable de la cadena ligera kappa de ratón o uno o más segmentos génicos V, y J de los mismos se sustituyen un situ con el locus de la región variable de la cadena ligera kappa humana o uno o más segmentos génicos V y J de los mismos;

o el locus de la región variable de la cadena ligera lambda de ratón o uno o más segmentos génicos V y J de los mismos; o el locus de la región variable de la cadena ligera lambda de ratón o uno o más génicos V y J de los mismos están sustituidos in situ con un locus de la región variable de la cadena ligera lambda humana o uno o más segmentos génicos V y J de los mismos.

17. Una célula ES de ratón de la reivindicación 15, en la que los loci génicos de la región variable de las cadenas pesada y ligera está sustituidos in situ por sus ortólogos humanos.

18. Un procedimiento de crear, en una célula madre embrionaria de ratón (ES) , un locus génico endógeno flanqueado cadena abajo o cadena arriba o tanto cadena abajo como cadena arriba por un sitio de recombinación específico de sitio, que comprende:

a) crear un LTVEC mayor de 20 kb que comprende el sitio de recombinación específico de sitio, un brazo de homología cadena abajo que contiene una región que flanquea el extremo 3’ del locus génico endógeno y un brazo de homología cadena arriba dentro del locus; y/o crear un LTVEC mayor de 20 kb que comprende el sitio de recombinación específico de sitio, un brazo de homología cadena arriba que contiene una región que flanquea el extremo 5' de la región del locus génico endógeno y un brazo de homología cadena abajo dentro del locus; b) introducir el LTVEC o los LTVEC de (a) en la célula ES de ratón; y c) usar un ensayo cuantitativo para detectar modificación de alelo (MDA) en el locus génico endógeno para identificar una célula ES de ratón en (b) en el que el locus génico endógeno está flanqueado cadena abajo o cadena arriba o tanto cadena abajo como cadena arriba mediante el sitio de recombinación específico de sitio.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicho (s) LTVEC comprenden brazos de homología que totalizan más de 20 kb.

20. El procedimiento de la reivindicación 18 o 19, en el que dicho (s) LTVEC son de más de 100 kb.

21. Un procedimiento de crear, en una célula madre embrionaria de ratón (ES) , un locus génico endógeno variable de inmunoglobulina flanqueado por sitios de recombinación específicos de sitio, que comprende:

a) crear un LTVEC de más de 20 kb que comprende un sitio de recombinación específico de sitio, un brazo de homología cadena abajo que contiene la región inmediatamente adyacente, pero sin incluir, a los segmentos J del locus génico de la región variable de inmunoglobulina y un brazo de homología cadena arriba dentro del locus génico variable; b) introducir el LTVEC de (a) en una célula ES de ratón; y c) usar un ensayo cuantitativo para detectar modificación de alelo (MDA) en el locus génico variable para identificar las células ES de ratón en (b) en las que el sitio de recombinación específico de sitio flanquea al extremo cadena abajo del locus génico endógeno variable de la inmunoglobulina.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que dicho LTVEC comprende brazos de homología que totalizan más de 20 kb.

23. El procedimiento de la reivindicación 21 o 22, en el que dicho LTVEC son de más de 100 kb.

24. Un procedimiento de crear, en una célula madre embrionaria de ratón (ES) , un locus génico endógeno variable de inmunoglobulina flanqueado por sitios de recombinación específicos de sitio, que comprende:

a) crear un LTVEC de más de 20 kb que comprende un sitio de recombinación específico de sitio, un brazo de homología cadena arriba que contiene la región adyacente al segmento génico V más distal, pero no contiene ninguno de los segmentos génicos V del locus génico de la región variable de inmunoglobulina y un brazo de homología cadena abajo dentro del locus; b) introducir el LTVEC de (a) en una célula ES de ratón; y c) usar un ensayo cuantitativo para detectar modificación de alelo (MDA) en el locus génico variable para identificar las células ES de ratón en (b) en las que el sitio de recombinación específico de sitio flanquea al extremo cadena abajo del locus génico endógeno variable de la inmunoglobulina.

25. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que dicho LTVEC comprende brazos de homología que totalizan más de 20 kb.

26. El procedimiento de la reivindicación 24 o 25, en el que dicho LTVEC son de más de 100 kb.

27. Un procedimiento de crear, en una célula madre embrionaria de ratón (ES) , un locus génico endógeno variable de inmunoglobulina flanqueado por sitios de recombinación específicos de sitio, que comprende:

a) crear un LTVEC de más de 20 kb que comprende un sitio de recombinación específico de sitio, un brazo de homología cadena abajo que contiene la región inmediatamente adyacente, pero sin incluir, a los segmentos J del locus génico de la región variable de inmunoglobulina y un brazo de homología cadena arriba dentro del locus; b) crear un LTVEC de más de 20 kb que comprende un sitio de recombinación específico de sitio, un brazo de homología cadena arriba que contiene la región adyacente al segmento génico V más distal, pero no contiene ninguno de los segmentos génicos V del locus génico de la región variable de inmunoglobulina y un brazo cadena abajo dentro del locus; c) introducir los LTVEC de (a) y (b) en la célula ES de ratón; y d) usar un ensayo cuantitativo para detectar modificación de alelo (MDA) en el locus génico variable para identificar una célula ES de ratón (c) en las que los sitios de recombinación específicos de sitio flanquean al locus génico endógeno de la región variable de inmunoglobulina.

28. El procedimiento de la reivindicación 27, en el que dicho LTVEC comprende brazos de homología que totalizan más de 20 kb.

29. El procedimiento de la reivindicación 27 o 28, en el que dichos LTVEC son de más de 100 kb.

30. Un procedimiento de crear, en una célula madre embrionaria de ratón (ES) , un locus génico endógeno flanqueado cadena abajo o cadena arriba o tanto cadena abajo como cadena arriba por un sitio de recombinación específico de sitio, que comprende:

a) crear un LTVEC mayor de 20 kb que comprende el sitio de recombinación específico de sitio, un brazo de homología cadena abajo que contiene una región homóloga en el extremo 3’ del locus génico endógeno y un brazo de homología cadena arriba dentro del locus; y/o crear un LTVEC mayor de 20 kb que comprende el sitio de recombinación específico de sitio, un brazo de homología cadena arriba que contiene una región homóloga en el extremo 5' de la región del locus génico endógeno y un brazo de homología cadena abajo dentro del locus. b) introducir el LTVEC o los LTVEC de a) en la célula ES de ratón; y c) usar un ensayo cuantitativo para detectar modificación de alelo (MDA) en el locus génico endógeno para identificar una célula ES de ratón en (b) en el que el locus génico endógeno está flanqueado cadena abajo o cadena arriba o tanto cadena abajo como cadena arriba mediante el sitio de recombinación específico de sitio.

31. El procedimiento de la reivindicación 30, en el que el (los) sitio (s) de recombinación específica de sitio se seleccionan de loxP, lox511 y lox2272.

32. El procedimiento de la reivindicación 30 o 31, en el que dichos LTVEC comprenden brazos de homología que totalizan más de 20 kb.

Figura 1

FIGURA 3A FIGURA 3B FIGURA 3C FIGURA 3D