PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN DE HISTONAS CARBONILADAS.

La presente invención es un procedimiento de identificación de histonas carboniladas,

que comprende separar electroforéticamente dichas histonas en un gel que comprende acrilamida, Tritón X-100, ácido acético glacial y urea, incubar dicho gel con 2,4-dinitrofenil hidracina (DNPH), separar electroforéticamente dichas histonas en un gel que comprende acrilamida, Tris y dodecilsulfato sódico, transferir dichas histonas desde el gel anterior a una membrana adsorbente, detectar la presencia de 2,4-dinitrofenil (DNP) en dicha membrana adsorbente e identificar dichas histonas carboniladas y sus variantes. La invención también proporciona un kit de identificación de histonas carboniladas que comprende reactivos para preparar un gel TAU, reactivos para preparar un gel SDS-PAGE, 2,4-dinitrofenil hidracina, anticuerpo primario específico frente a DNP y anticuerpo secundario marcado frente al anticuerpo primario.

Procedimiento de identificación de histonas carboniladas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento de identificación de histonas carboniladas mediante técnicas bioquímicas que incluyen la electroforesis bidimensional, derivatización química de los grupos carbonilo con 2, 4dinitrofenil hidracina (DNPH) y Western blot. La carbonilación de histonas tiene importancia en distintos procesos fisiológicos celulares, como el empaquetamiento del ADN en la cromatina, la regulación de la expresión génica y protección del ADN.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las histonas son proteínas muy básicas encargadas de empaquetar el ADN y por ello regulan la expresión de los genes y protegen al ADN. Distintas modificaciones post-traduccionales en las histonas, modificaciones químicas producidas en aminoácidos específicos de las histonas, configuran el “Código de las histonas” implicado en el control y la regulación de distintos procesos fisiológicos celulares. Existen distintas pan-histonas que constituyen el núcleo nucleosomal denominadas H3, H4, H2A y H2B, además de la histona de unión H1. Adicionalmente, cada una de ellas posee distintas variantes, entre ellas; H3.1, H3.2, H3.3, H3.X, H3.Y, H3.t, H10, H2AX, H2AZ. Estas distintas variantes solo pueden ser reconocidas mediante electroforesis bidimensional.

La técnica de separación de histonas y sus variantes mediante geles bidimensionales Triton-ácido acético-urea (2D-TAU) ha sido descrita anteriormente por Shechter et al. (Shechter, D. et al., Extraction, purification and analysis of histones. Nat Prot. 2007, 2 (6) : 1445-1457) . La electroforesis bidimensional (2D) de proteínas se compone de dos separaciones consecutivas consistentes en una primera separación conocida como Isoelectroenfoque y una segunda separación denominada electroforesis SDS-PAGE.

Por otra parte, existe un kit que permite la identificación de proteínas carboniladas mediante la técnica de derivatización de las proteínas con el reactivo 2, 4-dinitrofenil hidracina (DNPH) y posterior separación electroforética SDS-PAGE y uso de la técnica de Western blotting para la determinación de las proteínas carboniladas mediante un anticuerpo específico frente al grupo DNP (Oxyblot Protein Oxidation Detection Kit, Millipore, Billerica, MA) .

El análisis de la carbonilación de las histonas ha sido realizado previamente mediante electroforesis monodimensional no pudiendo analizar la carbonilación en las distintas variantes de las histonas (Sharma R. et al. Carbonyl modification in rat liver histones: decrease with age and increase by dietar y restriction. Free Rad Biol Med. 2006, 40: 1179-1184) .

El kit Oxyblot Protein Oxidation Detection Kit de Millipore está diseñado para producir la derivatización de las proteínas con DNPH antes de su separación electroforética. Pero este kit está diseñado para separaciones electroforéticas SDS-PAGE en una dimensión y por lo tanto su capacidad para determinar la carbonilación de histonas en un gel bidimensional no es posible. El inconveniente de usar esta estrategia para la determinación de la carbonilación de las histonas es que antes de separar electroforéticamente estas proteínas es necesario derivatizarlas con DNPH en condiciones ácidas. Por lo tanto, este proceso tiene una consecuencia crítica y es que este tratamiento produce el cambio de la carga de las histonas afectando su recorrido electroforético.

Por tanto, el problema que plantea la técnica es separar electroforéticamente las histonas y sus variantes e identificar las histonas carboniladas derivatizadas con DNPH sin que dicha derivatización afecte al recorrido electroforético de las histonas. La solución que propone la presente invención es la realización de una separación electroforética en función de su carga, la derivatización de las histonas con el reactivo DNPH y la separación electroforética en función de su tamaño.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención es un procedimiento de identificación de histonas carboniladas, que comprende:

(a) separar electroforéticamente dichas histonas en un gel que comprende acrilamida, Tritón X-100, ácido acético glacial y urea,

(b) incubar dicho gel con 2, 4-dinitrofenil hidracina (DNPH) ,

(c) separar electroforéticamente dichas histonas en un gel que comprende acrilamida, Tris y dodecilsulfato sódico,

(d) transferir dichas histonas desde el gel de la etapa (c) a una membrana adsorbente,

(e) detectar la presencia de 2, 4-dinitrofenil (DNP) en dicha membrana adsorbente e identificar dichas histonas carboniladas.

En la etapa (a) del procedimiento de la invención se realiza una separación electroforética de las histonas en función de su carga. La técnica presentada requiere de un sistema más sencillo que el sistema de electroisoenfoque para la separación de las histonas por carga, y únicamente requiere de un sistema de electroforesis convencional y cambiar la polaridad de los bornes.

En esta separación, un soporte electroforético constituido por un gel de poli-acrilamida, urea, ácido acético y Triton X100 (gel TAU) sirve para la separación de las proteínas según su carga tras la aplicación de una corriente eléctrica. La naturaleza del gel y la electricidad aplicada entre los electrodos produce un gradiente de pH a lo largo del gel que permite la separación. Las distintas proteínas migran a través del gel por la influencia del potencial eléctrico aplicado, hasta que alcanzan su respectivo punto isoeléctrico. El gel TAU permite la separación de las distintas histonas gracias a la presencia de la urea que permite desnaturalizar las histonas sin afectar la carga (como ocurriría en un SDS) . La adición del Triton X-100 que interacciona con los residuos hidrofóbicos de las variantes de las histonas, sobre todo de las variantes H3.1, H3.2 y H3.3, así como el uso del ácido acético glacial que permite mantener cada una de las histonas en un estado protonado particular para cada una de las histonas, permite la separación de las variantes de las histonas.

En la etapa (b) del procedimiento de la invención se derivatiza el gel TAU que contiene las proteínas separadas en la primera dimensión usando una disolución de DNPH 10 mM en ácido trifluoroacético al 10% en agua durante 20 minutos. El reactivo DNPH reacciona con los grupos carbonilo de las proteínas carboniladas, para dar lugar a una base de Schiff estable. De forma que una realización preferible es el procedimiento de la invención, donde en la etapa (b) se incuba dicho gel en una disolución de DNPH 10 mM en ácido trifluoroacético al 10% en agua.

En la etapa (c) del procedimiento de la invención se realiza una separación electroforética de las histonas en función de su tamaño. Una tira de poliacrilamida obtenida del gel de la etapa (a) se deposita en la parte superior de un gel SDS-PAGE. En las electroforesis SDS-PAGE, se utiliza el detergente dodecil sulfato sódico como agente desnaturalizante, minimizando el efecto de la distinta carga eléctrica de las proteínas. Las proteínas que forman un complejo con este detergente SDS están altamente cargadas con una relación carga/aminoácido constante por lo que la movilidad electroforética de las proteínas solamente depende de su peso molecular, avanzando más las moléculas de bajo peso molecular, siendo en el caso de las histonas el siguiente orden: H4, H2A, H2B, H3 y H1 con sus respectivas variantes.

En la etapa (d) del procedimiento de la invención el gel es desmontado de su soporte de cristal y transferido a una membrana adsorbente aplicando una corriente eléctrica. Tras esta transferencia a un nuevo soporte, las proteínas pueden ser identificadas con anticuerpos específicos. De forma que otra realización preferible es el procedimiento de la invención, donde dicha membrana adsorbente de la etapa (d) es una membrana de nitrocelulosa o polifluoruro de vinilideno (PVDF) .

Otra realización preferible es un procedimiento de la invención, donde la detección de la presencia de DNP de la etapa

(e) comprende:

(f) incubar dicha membrana adsorbente con un anticuerpo primario específico frente a DNP,

(g) incubar dicha membrana adsorbente con un anticuerpo secundario marcado frente al anticuerpo primario,

(h) detectar dicho anticuerpo secundario marcado.

La etapa (e) del procedimiento de la invención comprende incubar dicha membrana adsorbente con un anticuerpo primario específico frente a DNP, incubar dicha membrana adsorbente con un anticuerpo secundario marcado frente al anticuerpo primario, incubar dicha membrana con un reactivo quimioluminiscente o con un reactivo...

1. Un procedimiento de identificación de histonas carboniladas, que comprende:

(a) separar electroforéticamente dichas histonas en un gel que comprende acrilamida, Tritón X-100, ácido acético glacial y urea,

(b) incubar dicho gel con 2, 4-dinitrofenil hidracina (DNPH) ,

(c) separar electroforéticamente dichas histonas en un gel que comprende acrilamida, Tris y dodecilsulfato sódico,

(d) transferir dichas histonas desde el gel de la etapa (c) a una membrana adsorbente,

(e) detectar la presencia de 2, 4-dinitrofenil (DNP) en dicha membrana adsorbente e identificar dichas histonas carboniladas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde en la etapa (b) se incuba dicho gel en una disolución de DNPH 10 mM en ácido trifluoroacético al 10% en agua.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 2, donde dicha membrana adsorbente de la etapa (d) es una membrana de nitrocelulosa o polifluoruro de vinilideno (PVDF) .

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la detección de la presencia de DNP de la etapa (e) comprende:

(f) incubar dicha membrana adsorbente con un anticuerpo primario específico frente a DNP,

(g) incubar dicha membrana adsorbente con un anticuerpo secundario marcado frente al anticuerpo primario,

(h) detectar dicho anticuerpo secundario marcado.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, donde dicho anticuerpo secundario marcado comprende un compuesto seleccionado entre el grupo compuesto por peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y biotina.

6. Un kit de identificación de histonas carboniladas para su uso en el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende reactivos para preparar un gel TAU, reactivos para preparar un gel SDS-PAGE, 2, 4-dinitrofenil hidracina, anticuerpo primario específico frente a DNP y anticuerpo secundario marcado frente al anticuerpo primario.

7. Kit según la reivindicación 6, donde dichos reactivos para preparar un gel TAU son urea, acrilamida, bisacrilamida, ácido acético glacial, Tritón X-100, N, N, N’, N’-tetrametilletilendiamina y persulfato amónico.

8. Kit según una de las reivindicaciones 6 ó 7, donde dichos reactivos para preparar un gel SDS-PAGE son acrilamida, bisacrilamida, Tris, dodecilsulfato sódico, persulfato amónico, N, N, N’, N’-tetrametiletilendiamina.