PROCEDIMIENTO DE CRIBADO DE MUTAGENESIS DE ALTA PRODUCTIVIDAD.

Variante de cutinasa que comprende una sustitución de uno o más aminoácidos en posiciones de residuo que corresponden a los sitios 34,

73, 75, 77, 78, 79, 80, 99, 164, 191-196, 219, 223 y 225 de cutinasa de Pseudomonas mendocina ID SEC Nº: 2, en la que dicha variante de cutinasa es termoestable y tiene actividad hidrolítica sobre poliéster

Procedimiento de cribado de mutagénesis de alta productividad.

Campo de la invención

La invención proporciona variantes de cutinasa que proporcionan estabilidad y actividad mejoradas en comparación con la cutinasa de tipo salvaje.

Antecedentes de la invención

Se usan varios procedimientos de mutagénesis en la modificación de proteínas para obtener proteínas con propiedades y/o capacidades deseadas. En la mayoría de estos procedimientos, se muta la secuencia de nucleótidos de un gen clonado que codifica una proteína y se expresa el gen modificado para producir mutantes, que a continuación se someten normalmente a cribado para actividades de interés. A continuación, las actividades de las proteínas mutantes se comparan habitualmente con las de proteínas de tipo salvaje.

En la técnica se conoce una serie de procedimientos de mutagénesis. Un procedimiento general implica mutagénesis de saturación de sitios, que produce una población de genes mutados que consiste en genes por lo demás idénticos, pero incluye codones introducidos aleatoriamente. El codón introducido aleatoriamente puede codificar para cualquier aminoácido, y se dice que la posición está "saturada" (Airaksinen y Hovi, Nucleic Acids. Res. 26:576-581[1998]). Existen varios procedimientos diferentes de saturación de sitios conocidos en la técnica.

Como la mayoría de los procedimientos de mutagénesis proporcionan un gran número de opciones de mutación de aminoácidos, generalmente se requiere el cribado de un gran número de variantes para producir una propiedad de proteína deseada. Generalmente, el cribado se repite múltiples veces con el fin de producir una variante beneficiosa de interés. Así, existe una necesidad continuada en la técnica de procedimientos de mutagénesis y cribado que proporcionen facilidad de uso relativa así como que sean eficaces en términos de protocolos y análisis de datos, con el fin de obtener resultados de ingeniería de proteínas.

El documento EP-0.268.452 describe una cutinasa P. putida ATCC53552, actualmente clasificada como P. mendocina.

Resumen de la invención

La presente solicitud describe procedimientos de mutagénesis para ingeniería de proteínas. En particular, la presente solicitud describe procedimientos de mutagénesis que incluyen ajuste de realimentación a partir de evaluación sistemática de los resultados. Más específicamente, la solicitud describe procedimientos de mutagénesis de saturación de sitios que criban variantes con una o más propiedades deseables de proteínas y evalúa los resultados del cribado para proporcionar realimentación para repetir el cribado y la construcción de nuevas genotecas. La invención proporciona variantes de cutinasa que proporcionan estabilidad y actividad mejoradas en comparación con la cutinasa de tipo salvaje.

Los procedimientos de cribado de mutagénesis de alta productividad seleccionan sitios para barrido de saturación que usan consideraciones estructurales de las proteínas. En realizaciones preferidas, se crean genotecas de saturación de sitios y se criban usando ensayos seleccionados para identificar clones que tengan propiedades de proteínas de interés. Los sitios de mutación se categorizan basándose en sus propiedades de interés, y se identifican tendencias, si existieran. Se selecciona un variante o múltiples variantes que tengan al menos una propiedad deseada para procedimientos de creación de genotecas adicionales. Estas genotecas adicionales se crean usando realimentación a partir de las categorías determinadas. Un conjunto de genotecas adicionales repite la construcción de las genotecas anteriores usando la realimentación. Un segundo conjunto de genotecas adicionales representa nuevas genotecas creadas en sitios de los que se espera que sean beneficiosos basándose en la realimentación. En algunas realizaciones estas categorías se codifican (es decir, usando color u otros indicios), para permitir una fácil identificación de tendencias.

La presente invención proporciona numerosas variantes de cutinasa. Estas variantes comprenden una sustitución de uno o más aminoácidos en posiciones de residuo correspondientes a sitios 34, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 99, 164, 191-196, 219, 223 y 225 de cutinasa de Pseudomonas mendocina ID SEC Nº: 2, en la que dicha variante de cutinasa es termoestable y tiene actividad hidrolítica sobre poliéster. En algunas realizaciones preferidas especialmente, las variantes proporcionan actividad mejorada en diversas condiciones y/o estabilidad mejorada en comparación con la cutinasa de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona variantes de cutinasa de cutinasa de Pseudomonas mendocina ID SEC Nº: 2, en la que las variantes comprenden sustitución de Phe 194 por Pro, sustitución de Ser 219 por Gly, y una o más sustituciones adicionales en al menos una posición de aminoácido seleccionada entre las posiciones de aminoácidos 54, 78, 81, 191, 196, 200, 204 y 263.

En algunas realizaciones, las variantes tienen posición de aminoácido 54 sustituida por Ser, Glu o Thr. En otras realizaciones, la posición de aminoácido 78 está sustituida por Val. En realizaciones adicionales, la posición de aminoácido 81 está sustituida por Ser. En aún más realizaciones adicionales, la posición de aminoácido 191 está sustituida por Asn o His. En otras realizaciones, la posición de aminoácido 196 está sustituida por Leu o Ala. En realizaciones adicionales, la posición de aminoácido 200 está sustituida por Leu. En otras realizaciones adicionales, la posición de aminoácido 204 está sustituida por Leu. En realizaciones adicionales, la posición de aminoácido 263 está sustituida por Pro.

La presente invención proporciona también variantes de cutinasa que comprenden una sustitución de uno o más aminoácidos en posiciones de residuo que corresponden a los sitios 34, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 99, 164, 191-196, 219, 223 y 225 de cutinasa de Pseudomonas mendocina ID SEC Nº: 2, en las que las variantes de cutinasa tienen actividad de poliesterasa. En algunas realizaciones, las variantes de cutinasa comprenden la sustitución de GLY 73 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Phe, Lys, Leu y Val, y en las que la variante de cutinasa tiene estabilidad incrementada en comparación con cutinasa de tipo salvaje. En otras realizaciones, la variante de cutinasa comprende la sustitución de Thr 191 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en His, Leu y Tyr, y en la que la variante de cutinasa tiene estabilidad incrementada en comparación con cutinasa de tipo salvaje. En realizaciones alternativas, la variante de cutinasa comprende la sustitución de Thr 78 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Ala, Leu y Val, y en la que la variante de cutinasa tiene estabilidad incrementada en comparación con cutinasa de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la variante de cutinasa comprende la sustitución de Tyr 164 por Phe, y en la que la variante de cutinasa tiene estabilidad incrementada en comparación con cutinasa de tipo salvaje. En otras realizaciones más, la variante de cutinasa comprende la sustitución de Tyr 196 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Ala, Leu y Pro, y en la que la variante de cutinasa tiene estabilidad incrementada en comparación con cutinasa de tipo salvaje. En otras realizaciones adicionales, la variante de cutinasa comprende la sustitución de Phe 194 y la sustitución de Ser 219, y en la que la variante de cutinasa tiene estabilidad incrementada en comparación con cutinasa de tipo salvaje. En realizaciones adicionales, Phe en posición 194 se sustituye por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Ala, His, Lys, Leu, Asn, Pro y Gly, y en que Ser 219 se sustituye por Gly. En algunas realizaciones preferidas especialmente, la variante de cutinasa tiene actividad incrementada de poliesterasa en comparación con cutinasa de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la variante de cutinasa comprende la sustitución de Ala 80 por Glu, y en la que la variante de cutinasa tiene estabilidad incrementada en comparación con cutinasa de tipo salvaje. En realizaciones adicionales preferidas, la variante de cutinasa comprende la sustitución de Phe 194 por Ile, y la variante de cutinasa tiene actividad incrementada de poliesterasa en comparación con cutinasa de tipo salvaje. En otras realizaciones adicionales, la variante de cutinasa comprende la sustitución de Phe 194 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Lys y Leu, y la sustitución de Ser 219 por Gly, y la variante de cutinasa tiene...

1. Variante de cutinasa que comprende una sustitución de uno o más aminoácidos en posiciones de residuo que corresponden a los sitios 34, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 99, 164, 191-196, 219, 223 y 225 de cutinasa de Pseudomonas mendocina ID SEC Nº: 2, en la que dicha variante de cutinasa es termoestable y tiene actividad hidrolítica sobre poliéster.

2. Variante de cutinasa según la reivindicación 1, en la que dicha variante comprende las sustituciones de Phe 194 por Pro, Ser 219 por Gly y una o más sustituciones adicionales seleccionadas entre las posiciones de aminoácidos 54, 78, 81, 191, 196, 200, 204, y 263.

3. Variante de cutinasa según la reivindicación 2 en la que: