PROCEDIMIENTO PARA ALTERAR EL PATRÓN DE DESARROLLO, AUMENTAR EL CRECIMIENTO Y LA ACUMULACIÓN DE ALMIDÓN Y ALTERAR LA ESTRUCTURA DEL ALMIDÓN EN PLANTAS MEJORADO.

5 alargamiento del hipocótilo, iniciación de las pilosidades radiculares, la senescencia de hojas y flores y la maduración de los frutos. Además, recientemente, Splivallo et al. (Splivallo et al. 2009) aportaron evidencias de que el etileno producido por las trufas induce alteraciones en el desarrollo de plantas de Arabidopsis .. En lo que se refiere a las bacterias, los escasos trabajos en los que se describía el efecto de volátiles microbianos sobre el crecimiento de plantas giran en tomo a un número limitado de cepas especializadas de rizobacterias promotoras del crecimiento de plantas (PGPR: plant growth promoting rhizobacteria) . Se denomina rizobacterias a ciertas bacterias simbiontes que existen en el suelo y que colonizan las raíces de las 10 plantas. La mayor parte de las cepas cuyo cultivo da lugar a un efecto positivo sobre el 15 20 crecimiento de las plantas cultivadas en su presencia, sin necesidad de contacto fisico, pertenecen al género Bacillus o un género estrechamente relacionado con éste, Paenibacillus, al cual pertenecen bacterias que en el pasado fueron clasificadas como pertenecientes al género Bacillus. Así, por ejemplo, se ha demostrado que volátiles emitidos por rizobacterias de cepas pertenecientes a las especies Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens o Bacillus cepacia promueven el crecimiento de plantas de Arabidopsis, facilitando la toma de nutrientes, la fotosíntesis y la respuesta de defensa, y disminuyendo la sensibilidad a la glucosa y los niveles de ácido abscísico (Ryu et al. 2003; Ryu et al. 2004; Vespermann et al. 2007; Xie et al. 2009) . En concreto, Ryu et al. (Ryu et al. 2003) describen que los volátiles orgánicos liberados por cepas específicas de PGPR, concretamente Bacillus subtilis GB03 y Bacillus amyloliquefaciens IN937a, son capaces de provocar un incremento del crecimiento de plántulas de Arabidopsis thaliana. El efecto se observa cuando las citadas cepas de bacterias son cultivadas en el medio rico en aminoácidos agar con tripticasa de soja. En esas condiciones, ambas 25 bacterias liberan 3-hidroxi-2-butanona (acetoína) y 2, 3-butanediol. Dichos compuestos parecen ser los responsables del efecto observado, porque no son emitidos por las otras PGPR ensayadas que no mostraban efectos sobre el crecimiento de las plantas, pero, sin embargo, sí son liberados por otras cepas bacterianas con capacidad de incrementar la germinación y el crecimiento de plantas. Tal es el caso de la cepa de Bacillus subtilis 30 WG6-14, objeto de la solicitud de patente US 2008/0152684 Al, que produce los mismos volátiles y es capaz de incrementar el crecimiento y la germinación de plantas como Brassica oleracea sin existir contacto fisico entre planta y bacteria. Sin embargo, existen muchas bacterias liberadoras de estas mismas sustancias (algunas pertenecientes al género Bacillus) que no promueven el crecimiento de la planta. Se han descrito también otras cepas de los géneros Bacillus o Paenibacillus que emiten volátiles capaces de promover el crecimiento de distintas plantas pero, en estos 5 casos, el efecto parece estar ligado principalmente a la capacidad de controlar el crecimiento de patógenos que están afectando a la planta. Tal es el caso, por ejemplo, del bacilo Kyu-W63 descrito en la patente japonesa JP10033064, cuyos volátiles son capaces de controlar la patopoyesis debida a la presencia de hongos del género Cercospora en hojas de pepino, facilitando con ello el crecimiento de la planta. La 10 descripción sugiere que el efecto podría ser similar utilizando otras bacterias filamentosas, siempre y cuando el cultivo se produzca en un medio rico en azúcares tal como el agar PDA, medio que no se define con más detalle; tampoco se dan pruebas que demuestren la influencia del medio sugerido o la aplicabilidad del método para cualquier otra bacteria filamentosa. 15 20 25 También el método para incrementar el crecimiento de plantas, basado en composiciones que comprenden un metabolito volátil producido por una bacteria, que se reivindica en la solicitud de patente coreana KR20090066412, alude de forma combinada a la inducción de protección contra enfermedades y el ataque de insectos y a la promoción del crecimiento de distintas plantas, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Como ejemplos de posibles metabolitos útiles se citan 3-acetil-l-propano1, 3-metil-l-butano1, indol, acetato de isoamilo y acetato de buti10. El resumen menciona que los posibles microorganismos que dan lugar a un metabolito volátil con el efecto buscado comprenden bacterias pertenecientes a los géneros Bacillus o Paenibacillus, siendo una cepa de la especie Paenibacillus polymyxa el microorganismo preferido. En la solicitud de patente principal P201000499, se divulgaba el descubrimiento de que, al crecer plantas en presencia de cualquier tipo de microorganismo (bacterias Gram-positivas o Gram-negativas, levaduras u hongos) , los volátiles emitidos por el microorganismo dan lugar a que se produzca una alteración el patrón de desarrollo y un aumento en el crecimiento, la fertilidad y el peso seco de las plantas, que iba 30 acompañado de un incremento en la acumulación de almidón en las mismas. Estos efectos se observan tanto en plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas (Arabidopsis, maíz, cebada, tabaco, patata ... ) , y son independientes de que el microorganismo sea o no patógeno para la planta y de que pertenezca o no a una especie que no convive con la planta en condiciones naturales. Estos efectos se observan tanto si las plantas se cultivan in vitro como en tierra, siempre y cuando la planta se cultive en presencia de un cultivo de un microorganismo que emita volátiles o bien en presencia de los volátiles microbianos emitidos por el microorganismo y, preferiblemente, cuando el 5 microorganismo se hacía crecer en un medio que carezca de compuestos orgánicos que presenten grupos amino, especialmente si el medio carece de aminoácidos, tal como los medios mínimos suplementados con al menos un compuesto orgánico como fuente de carbono. Dado que la aparición de los efectos descritos no requería de contacto fisico entre la planta y el microorganismo, se concluía que los volátiles eran los responsables 10 de los efectos observados. 15 20 En la solicitud P210100499 se comentaba que la alteración en el patrón de desarrollo de la planta se manifiesta por un aumento del número de hojas, el número de ramas, el número de flores y semillas e induciendo la floración. En el caso concreto del crecimiento de plantas en presencia de un cultivo del hongo Alternaría alternata, cultivada en medio MS sólidos suplementado con 90 mM sacarosa, y la presencia de los volátiles fúngicos emitidos por este hongo daba lugar no sólo a un aumento del crecimiento general de la planta, sino también a la alteración de distintos aspectos del patrón de desarrollo. Se aportaban datos para varias plantas: Arabidopsis thaliana: incremento de peso seco, número de flores, número de vainas, longitud del brote y número de ramas. Tabaco (Nicotiana tabacum) : incremento del tamaño general, del número de hojas, del tamaño de la raíz Maíz: incremento del tamaño general También se mostraban, entre otros, datos sobre el incremento del almidón en 25 plantas sometidas al efecto de los volátiles fúngicos producidos por Alternaria 30 alternata, aportándose como ejemplo datos obtenidos de Arabidopsis thaliana, maíz, patata, cebada y tabaco. Se demostraba también que otros hongos y bacterias, particularmente cuando se hacían crecer en un medio carente de aminoácidos y/o proteínas, eran capaces de producir efectos similares. Por ello, entre otros aspectos, la solicitud P201000499 divulgaba un método para incrementar el crecimiento de una planta y/o alterar su patrón de desarrollo caracterizado porque la planta se cultiva en una atmósfera en la que están presentes los compuestos volátiles emitidos por un microorganismo, microorganismo que podía haber sido cultivado en un lugar diferente al lugar de cultivo de la planta, recogiéndose la mezcla de volátiles emitidos por el mismo y cultivándose la planta en una atmósfera en la que estuvieran presentes esos volátiles. Se decía que la planta podía ser una angIOsperma, una monocotiledónea o una dicotiledónea, y se comentaba que el 5 incremento del crecimiento se podía manifestar en un aumento de la longitud de la planta y/o en un aumento del tamaño de las hojas, mientras que la alteración del patrón de crecimiento se podía manifestar en incremento del número de hojas, incremento del número de ramas y/o del número de flores y semillas de plantas angiospermas, inducción de la floración, o en combinaciones de las anteriores. 10 15 20 La solicitud P201000499, además, divulgaba cuáles eran las modificaciones en el metabolismo de las plantas mediante las cuales los volátiles microbianos provocan el incremento... [Seguir leyendo]

1. Un método para incrementar en una planta la resistencia al estrés hídrico en el que la planta se cultiva en presencia de un cultivo de un microorganismo que produce 5 compuestos volátiles, sin que exista contacto entre la planta y el microorganismo, o en presencia de los volátiles emitidos por el microorganismo. 10 15 20 25 30 ""'O 00 ""'O r--"<t , .......; OÍ) . ~ ""'O <=> "<t Maíz A 90 El -FV 80 El+FV 70 E 60 ~ ~ 50 "" ~ 40 30 20 10 o 7 14 21 28 35 42 oras B 10 El -FV 9 8 <J) «1 7 "O .r:. 6 al -c 5 e al 4 E -"" 3 Z 2 1 o 7 14 21 28 35 42 oras e 2.5 El -FV 2.0 2E Cl OJ 1.5 .s «1 ¡¡:: 1.0 e o o 0.5 o oras O 12 El -FV El+FV E 10 ~ ..Q .

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