Procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de cualquier material de partida.

Formulaciones para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de materiales que contienen ácidos nucleicos que comprenden

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al menos un tampón de lisis con sales caotrópicas como componentes que contiene adicionalmente al menos una enzima proteolítica y al menos un detergente y

• al menos un tampón de unión con sales no caotrópicas como componentes que contiene adicionalmente al menos un alcohol y al menos un detergente,

caracterizado porque la concentración de las sales caotrópicas componentes del tampón de lisis es inferior a 100 mM y la concentración de las sales no caotrópicas componentes del tampón de unión es inferior a 1 M.

Procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de cualquier material de partida.

El objeto de la invención es un procedimiento universal y considerablemente simplificado para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de diversos materiales de partida que contienen ácidos nucleicos, que garantice una gran calidad de los ácidos nucleicos que se aíslan, así como su aislamiento con rendimientos cuantitativos.

En las condiciones clásicas, el aislamiento de ADN a partir de células y tejidos tiene lugar de modo que los materiales de partida que contienen los ácidos nucleicos se disgregan en condiciones fuertemente desnaturalizantes y reductoras, en parte también con el uso de enzimas que degradan las proteínas, la fracción de los ácidos nucleicos liberada se purifica mediante etapas de extracción con fenol y cloroformo y los ácidos nucleicos se obtienen de la fase acuosa mediante diálisis o precipitación con etanol (Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning”) .

Estos “procedimientos clásicos” para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de células y especialmente de tejidos consumen mucho tiempo (a veces más de 48 h) , requieren un gasto considerable en aparatos y además no pueden llevarse a cabo en las condiciones existentes sobre el terreno. Adicionalmente, debido a los productos químicos usados como fenol y cloroformo, estos procedimientos conllevan riesgos no despreciables para la salud.

Distintos procedimientos alternativos para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de diversos materiales de partida biológicos permiten evitar la extracción de dichos ácidos nucleicos mediante fenol y cloroformo, proceso laborioso y perjudicial para la salud, así como lograr una reducción del tiempo necesario.

Todos estos procedimientos se basan en un procedimiento desarrollado y descrito por primera vez por Vogelstein y Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615-619) para la purificación preparativa y analítica de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa. El procedimiento combina la disolución de la agarosa que contiene la banda de ADN que ha de aislarse en una disolución saturada de una sal caotrópica (NaJ) con la unión del ADN a partículas de vidrio. A continuación, el ADN fijado a las partículas de vidrio se lava con una disolución de lavado (Tris HCl 20 mM [pH 7, 2], NaCl 200 mM, EDTA 2 mM, etanol al 50% v/v) y después se separa de las partículas de soporte.

Hasta la fecha, este procedimiento ha sufrido numerosas modificaciones y actualmente se emplea en distintos procedimientos de extracción y purificación de ácidos nucleicos de diversas procedencias (Marko, M. A., Chipperfield, R. y Birnboim, H. G., 1982, Anal. Biochem., 121, 382-387) .

Además, en la actualidad existen en todo el mundo numerosos sistemas de reactivos, sobre todo para la purificación de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa y para el aislamiento de ADN plasmídico a partir de lisados bacterianos, pero también para el aislamiento de ácidos nucleicos de cadenas más largas (ADN genómico, ARN total celular) a partir de sangre, tejidos o también de cultivos celulares.

Todos estos kits disponibles comercialmente se basan en el principio suficientemente conocido de la unión de los ácidos nucleicos a soportes minerales en presencia de disoluciones de distintas sales caotrópicas y usan como materiales de soporte suspensiones de polvo de vidrio finamente molido (por ejemplo, Glasmilk, BIO 101, La Jolla, CA, EE. UU.) , tierra de diatomeas (Sigma) o también geles de sílice (Diagen, documento DE 4139664 A1) .

Un procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos practicable para numerosas aplicaciones diferentes se describe en el documento US 5.234.809 (Boom) . En dicho documento se describe un procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de materiales de partida que contienen ácidos nucleicos mediante la incubación del material de partida con un tampón caotrópico y una fase sólida que se une al ADN. Los tampones caotrópicos son responsables de la lisis del material de partida así como de la unión de los ácidos nucleicos a la fase sólida. El procedimiento es adecuado para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de pequeñas cantidades de muestra y encuentra aplicación práctica especialmente en el campo del aislamiento de ácidos nucleicos víricos.

Algunas modificaciones específicas de este procedimiento afectan al empleo de nuevos materiales de soporte, que muestran ventajas de aplicación para determinados planteamientos (documento WO-A 95/34569) .

En documentos de patente más recientes se desvela que para la adsorción de los ácidos nucleicos a los materiales silicatados conocidos y empleados por los expertos, pueden emplearse también de manera muy eficiente y satisfactoria las denominadas sales anticaotrópicas como componentes de los sistemas de tampones de lisis y de unión (documento EP 1135479) . La ventaja de este procedimiento es que al evitar el uso de sales caotrópicas, los sistemas de extracción suponen un riesgo considerablemente inferior para la salud. Sin embargo, para una extracción eficiente de los ácidos nucleicos a partir de una muestra biológica compleja, especialmente con respecto a la obtención de los ácidos nucleicos con el mayor rendimiento posible, se necesitan a su vez grandes concentraciones de sales en el tampón de lisis (> 1, 5 M) . Así, el documento de patente desvela que los tampones de lisis que se usan contienen concentraciones de sales entre 1, 5 M y 3 M.

En el documento de patente DE 4321904 se describe un procedimiento en el que es posible un aislamiento eficiente de ácidos nucleicos mediante la combinación de un tampón caotrópico de alta concentración de sales con componentes alcohólicos. A este respecto, los tampones de lisis indicados en el documento de patente contienen siempre concentraciones de sales de 4 M a 8 M y como sales se emplean especialmente clorhidrato de guanidinio, tiocianato de guanidinio o yoduro de potasio. Es sabido que estas sales son responsables de la lisis del material de partida, así como de una potente inactivación de enzimas nucleolíticas. Después de la lisis del material de partida, se añade un alcohol. El documento de patente desvela que la adición de componentes alcohólicos a un tampón de lisis con alta concentración de sales da lugar a una unión especialmente eficiente de los ácidos nucleicos a los materiales filtrantes silicatados que se emplean. Sin embargo, la desventaja del uso de tampones de lisis con sales caotrópicas de alta fuerza iónica es siempre el empleo solo limitado y además ineficiente de enzimas proteolíticas adicionales para la disgregación eficiente de muestras biológicas complejas, ya que las propias enzimas quedan dañadas por la acción desnaturalizante de proteínas de los tampones caotrópicos. Además, son necesarias exhaustivas etapas de lavado posteriores para eliminar las altas concentraciones de sales del material de adsorción empleado. El experto sabe que las sales caotrópicas ejercen un fuerte efecto inhibidor sobre numerosas aplicaciones posteriores.

El análisis del estado de la técnica aclara de manera convincente que existen numerosas posibilidades para unir ácidos nucleicos a materiales de soporte sólidos, especialmente materiales de soporte minerales a base de silicio, que a continuación se lavan para volver a separar los ácidos nucleicos de dicho material de soporte. En ello, queda muy claro que para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de muestras biológicas complejas se emplean tanto las denominadas sales caotrópicas como las denominadas sales anticaotrópicas.

En el documento WO 2005/007895 A1 se describe un procedimiento para la purificación de ácidos nucleicos en un ensayo en fase sólida. Se desvela un procedimiento y kits para la preparación de un ácido nucleico y su unión a una fase sólida que comprenden una disolución de proteasa (tampón de lisis) que puede contener además una primera sal caotrópica y un detergente. La disolución de unión que ha de aplicarse a la fase sólida se obtiene por adición de una segunda sal caotrópica.

El documento WO 91/07422 A1 desvela un reactivo de lisis con un tampón de lisis que contiene la sal caotrópica clorhidrato de guanidinio 0, 5-5 M, y además proteinasa K y detergentes como Triton X. La muestra lisada con este tampón se aplica sobre una fase sólida previamente preparada con una disolución de baja fuerza iónica. Después de la unión se llevan a cabo etapas de lavado y elución. La muestra en el tampón de lisis se diluye con un tampón de unión para disminuir la fuerza iónica antes de su aplicación a la columna.

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1. Formulaciones para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de materiales que contienen ácidos nucleicos que comprenden • al menos un tampón de lisis con sales caotrópicas como componentes que contiene adicionalmente al menos una enzima proteolítica y al menos un detergente y

• al menos un tampón de unión con sales no caotrópicas como componentes que contiene adicionalmente al menos un alcohol y al menos un detergente,

caracterizado porque la concentración de las sales caotrópicas componentes del tampón de lisis es inferior a 100 mM y la concentración de las sales no caotrópicas componentes del tampón de unión es inferior a 1 M.

2. Formulaciones de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizadas porque la concentración de las sales no caotrópicas componentes del tampón de unión es inferior a 500 mM.

3. Formulaciones de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizadas porque el componente alcohólico consta de alcoholes solubles en agua como metanol, etanol, propanol, isopropanol, etilenglicol, polietilenglicol o glicerina.

4. Formulaciones de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizadas porque la proporción del componente alcohólico es del 20 al 80 %, preferentemente del 45 al 55 %.

5. Formulaciones de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizadas porque como componente detergente se emplea al menos una de las sustancias polivinilpirrolidona, CTAB, Triton X-100, N-laurilsarcosina, citrato de sodio, DDT o Tween 20.

6. Formulaciones de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizadas porque adicionalmente comprenden una fase sólida.

7. Formulaciones de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizadas porque como fase sólida se emplean membranas de nilón cargadas positivamente, membranas de polisulfona, membranas de polietersulfona, membranas de PVDF, membranas de polímeros acrílicos, membranas intercambiadoras de iones, fritas de polietileno, simples papeles de filtro, partículas de óxido de hierro magnéticas o partículas de silicato.

8. Procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de materiales que contienen ácidos nucleicos mediante el uso de formulaciones de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende las etapas siguientes:

-lisis de los materiales de partida mediante el uso del tampón de lisis de acuerdo con la reivindicación 1,

-dado el caso, prefiltración,

- unión de los ácidos nucleicos a una fase sólida mediante el uso del tampón de unión de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2,

- lavado de los ácidos nucleicos unidos,

- elución de los ácidos nucleicos unidos.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque para el lavado de los ácidos nucleicos unidos se emplea una mezcla de tampones con sales caotrópicas y con sales no caotrópicas como componentes de acuerdo con la reivindicación 1.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque para la prefiltración y la adsorción final de los ácidos nucleicos se usa el mismo material.