Presentación del receptor de linfocitos T.

Una partícula fágica que presenta en su superficie un par de polipéptidos de los receptores de linfocitos T diméricos (dTCR),

donde dicho par de polipéptidos de dTCR está constituido por un primer polipéptido en el cual una secuencia del dominio variable de la cadena α o δ de TCR se fusiona al extremo N terminal de una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena α de TCR y un segundo polipéptido donde una secuencia del dominio variable de la cadena β o γ de TCR se fusiona al extremo N terminal de una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena β de TCR; donde el primer y segundo polipéptidos están unidos por un enlace disulfuro que corresponde al enlace disulfuro intercatenario nativo presente en los TCR αβ diméricos nativos.

Presentación del receptor de linfocitos T

La presente invención se refiere a partículas proteicas, por ejemplo partículas fágicas o ribosómicas, que presentan receptores de linfocitos T (TCR) y a colecciones variadas de éstas.

Antecedentes de la invención TCR nativos Como se describe por ejemplo en WO 99/60120, los TCR median el reconocimiento por los linfocitos T de complejos específicos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) -péptido y, como tales, son esenciales para el funcionamiento de la rama celular del sistema inmunitario.

Los anticuerpos y los TCR son los únicos dos tipos de moléculas que reconocen antígenos de manera específica, y por lo tanto el TCR es el único receptor para antígenos peptídicos particulares presentados por el MHC, siendo a menudo el péptido foráneo el único signo de una anomalía dentro de una célula. El reconocimiento por un linfocito T se produce cuando un linfocito T y una célula presentadora de antígeno (APC) están en contacto físico directo y se inicia mediante la unión de los TCR específicos del antígeno con los complejos pMHC.

El TCR nativo es una proteína heterodimérica de la superficie celular de la superfamilia de las inmunoglobulinas que se asocia a proteínas invariables del complejo CD3 implicado en la mediación de la transducción de señales. Los TCR existen en las formas αβ y γδ, que son estructuralmente similares pero tienen localizaciones anatómicas, y

probablemente funciones, bastante distinguibles. Los ligandos del MHC de clase I y clase II también son proteínas de la superfamilia de las inmunoglobulinas pero están especializados en la presentación de antígenos, con un sitio de unión del péptido altamente polimórfico que les permite presentar una matriz variada de fragmentos de péptidos cortos en la superficie de las células APC.

Se conocen otras dos clases de proteínas capaces de funcionar como ligandos de los TCR. (1) los antígenos CD1 son moléculas relacionadas a MHC clase I cuyos genes se encuentran en un cromosoma diferente del de los antígenos clásicos MHC de clase I y clase II. Las moléculas CD1 son capaces de presentar grupos peptídicos y no peptídicos (por ejemplo lípidos, glucolípidos) a los linfocitos T de manera análoga a los complejos MHC-pep convencionales de las clases I y II. Véase, por ejemplo (Barclay et al, (1997) The Leucocyte Antigen Factsbook 2ª Edición, Academic Press) y (Bauer (1997) Eur J Immunol 27 (6) 1366-1373) ) (2) Los superantígenos bacterianos con toxinas solubles capaces de unirse tanto a moléculas de MHC clase II como a un subconjunto de TCR. (Fraser (1989) Nature 339 221-223) Muchos superantígenos tienen especificidad por uno o dos segmentos Vbeta, mientras que otros muestran una unión más promiscua. En cualquier caso, los superantígenos son capaces de suscitar una mayor respuesta inmunitaria en virtud de su capacidad de estimular los subconjuntos de linfocitos T de forma policlonal.

La porción extracelular de los TCR heterodiméricos nativos αβ y γδ consiste en dos polipéptidos, cada uno de los cuales tiene un dominio constante proximal a la membrana y un dominio variable distal a la membrana. Cada uno de los dominios constante y variable incluye un enlace disulfuro intracatenario. Los dominios variables contienen bucles altamente polimórficos análogos a las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los anticuerpos. Las CDR3 de los TCR αβ interaccionan con el péptido presentado por MHC, y las CDR 1 y 2 de los TCR αβ con el

péptido y el MHC. La diversidad de las secuencias de los TCR se genera a través del reordenamiento somático de variable unida (V) , diversidad (D) , unión (J) y genes constantes Los polipéptidos de cadenas α y γ funcionales están formados por regiones V-J-C reordenadas, mientras que las cadenas β y δ consisten en regiones V-D-J-C. El dominio extracelular constante tiene una región proximal a la membrana y una región de inmunoglobulina. Hay dominios constantes de una sola cadena α y δ, conocidos como TRAC y TRDC, respectivamente. El dominio constante de la cadena β se compone de uno de los dos dominios constantes β diferentes, conocidos como TRBC1 y TRBC2 (nomenclatura de IMGT) . Existen cuatro cambios de aminoácidos entre estos dominios constantes β, tres de los cuales están dentro de los dominios utilizados para producir los TCR de una sola cadena presentados en las partículas fágicas de la presente invención. Estos cambios están todos dentro del exón 1 de TRBC1 y TRBC2: N4K5->K4N5 y F37->Y (numeración IMGT, diferencias TRBC1

>TRBC2) , con el cambio de aminoácido final entre las dos regiones constantes de la cadena β de TCR en el exón 3 de TRBC1 y TRBC2: V1->E. El dominio constante γ se compone de uno de TRGC1, TRGC2 (2x) o TRGC2 (3x) . Los dos dominios constantes TRGC2 difieren solamente en el número de copias de los aminoácidos codificados por el exón 2 de este gen que están presentes.

La extensión de cada uno de los dominios extracelulares de TCR es algo variable. Sin embargo, un experto en la materia puede determinar fácilmente la posición de los límites del dominio utilizando una referencia como The T Cell Receptor Facts Book, Lefranc & Lefranc, Publ. Academic Press 2001.

TCR recombinantes La producción de TCR recombinantes es beneficiosa ya que proporciona análogos de TCR solubles adecuados para los propósitos siguientes:

• Estudiar las interacciones TCR / ligando (por ej. pMHC para los TCR αβ)

• Detectar inhibidores de las interacciones asociadas a TCR

• Proporcionar la base para posibles terapias

Una serie de constructos han sido concebidos hasta la fecha para la producción de TCR recombinantes. Estos constructos caen dentro de dos amplias clases, los TCR de una sola cadena y los TCR diméricos, la bibliografía pertinente para estos constructos se resume más adelante.

Los TCR de una sola cadena (scTCR) son constructos artificiales que constan de una sola hebra de aminoácidos, que al igual que los TCR heterodiméricos nativos se unen a complejos MHC-péptido. Desafortunadamente, los intentos de producir scTCR análogos alfa/beta funcionales, simplemente uniendo las cadenas alfa y beta de modo que ambas se expresen en un marco de lectura abierto no han tenido éxito, presumiblemente debido a la inestabilidad natural del apareamiento del dominio soluble alfa-beta.

En consecuencia, han sido necesarias técnicas especiales que usan diferentes truncamientos de una o ambas de las cadenas alfa y beta para la producción de los scTCR. Estos formatos parecen ser aplicables solamente a una gama muy limitada de secuencias de los scTCR. Soo Hoo et al (1992) PNAS. 89 (10) : 4759-63 informan acerca de la expresión de un TCR de ratón en un formato de una sola cadena a partir del clon 2C del linfocito T utilizando una cadena beta y alfa truncada unida con un conector de 25 aminoácidos y expresión en periplasma bacteriano (véase también Schodin et al (1996) Mol. Immunol. 33 (9) : 819-29) . Este diseño también forma la base de TCR de una sola cadena m6 informado por Holler et al (2000) PNAS. 97 (10) : 97 (10) : 5387-92 que se deriva de scTCR 2C y se une al mismo aloepítopo restringido al H2-Ld. Shusta et al (2000) Nature Biotechnology 18: 754-759 y US 6, 423, 538 informan el uso de constructos TCR 2C murinos de una sola cadena en experimentos de presentación en levaduras, que produjeron TCR mutados con mayores estabilidad térmica y solubilidad. Este informe también demostró la capacidad de estos TCR 2C presentados de unirse selectivamente a células que expresan su pMHC análogo. Khandekar et al (1997) J. Biol Chem 272 (51) : 32190-7 informan de un diseño similar para el TCR D10 murino, aunque este scTCR se fusionó a MBP y se expresó en el citoplasma bacteriano (véase también Hare et al (1999) Nat, Struct. Biol 6 (6) : 574-81) . Hilyard et al (1994) PNAS. 91 (19) : 9057-61 informan de un scTCR humano específico para la proteína de matriz del virus de la gripe en HLA-A2, usando un diseño de Vα-conector-Vβ y y expresado en periplasma bacteriano.

Chung et al (1994) PNAS. 91 (26) 12654-8 Informan de la producción de un scTCR humano utilizando un diseño Vαconector-Vβ-Cβ y expresión en la superficie de una línea celular de mamífero. Este informe no incluye ninguna referencia a la unión específica péptido-HLA de scTCR. Plaksin et al (1997) J. Immunol. 158 (5) : 2218-27 informan de un diseño de Vα-conector-Vβ-Cβ similar para producir un scTCR murino específico para un epítopo gp120-H-2Dd de VIH.Este scTCR se expresa como... [Seguir leyendo]

1. Una partícula fágica que presenta en su superficie un par de polipéptidos de los receptores de linfocitos T diméricos (dTCR) , donde dicho par de polipéptidos de dTCR está constituido por un primer polipéptido en el cual una secuencia del dominio variable de la cadena α o δ de TCR se fusiona al extremo N terminal de una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena α de TCR y un segundo polipéptido donde una secuencia del dominio variable de la cadena β o γ de TCR se fusiona al extremo N terminal de una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena β de TCR; donde el primer y segundo polipéptidos están unidos por un enlace disulfuro que corresponde al enlace disulfuro intercatenario nativo presente en los TCR αβ diméricos nativos.

2. Una partícula fágica como la que se reivindica en la reivindicación 1 que es una partícula de un fago filamentoso.

3. Una partícula fágica como la que se reivindica en la reivindicación 1 o 2 donde el extremo C-terminal de un miembro del par de polipéptidos de dTCR está unida por un enlace peptídico a un residuo expuesto en la superficie de la partícula fágica.

4. Una colección variada de partículas fágicas como la que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

5. Una colección variada como la que se reivindica en la reivindicación 4 donde la variación reside en los dominios variables del par de polipéptidos de dTCR .

6. Un método para la identificación de los TCR con una característica específica, donde dicho método comprende someter una colección variada de TCR presentados en partículas fágicas según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5 a un proceso de selección que selecciona en función de dicha característica, y aislar las partículas fágicas que presentan un TCR con dicha característica, y opcionalmente a un proceso de amplificación para multiplicar las partículas aisladas, y/o a un proceso de cribado que mide dicha característica, identificando esas partículas fágicas que presentan un TCR con la característica deseada y aislando esas partículas fágicas, y opcionalmente a un proceso de amplificación para multiplicar las partículas aisladas.

7. Un método como el que se reivindica en la reivindicación 6 donde la característica específica es mayor afinidad por un ligando de TCR.

Figura 3 Figura 4

Figura 19ª Figura 19b Figura 20

Figura 21

xxx - codones de la cremallera de leucina de Fos xxx - codones del marcador de biotinilación Figura 22

xxx – sitios de enzima de restricción Figura 23

xxx - codones de cremallera de Leucina de Jun xxx – péptido cargado en HLA