Preparado farmaceútico para el tratamiento de arterioesclerosis que contiene como componente activo una sustancia de acción anti-apoptótica.

Preparado farmacéutico para el tratamiento de la arterioesclerosis,

que contiene como componente activo unasustancia activa antiapoptótica, que se une a por lo menos un compuesto seleccionado entre trombospondina-I (TSP-I),proteína asociada a integrina (IAP) e integrina αVß3 (αVß3) de tal modo que se inhibe la unión simultánea de TSP-1 a IAPy a αVß3, y caracterizado porque la sustancia es seleccionada entre el grupo compuesto por anticuerpos específicos y/ofragmentos de estos, que poseen un sitio de unión al antígeno, contra TSP-1, IAP y/o αVß3.

Preparado farmacéutico para el tratamiento de arterioesclerosis que contiene como componente activo una sustancia de acción anti-apoptótica La invención se refiere a un procedimiento para la identificación de sustancias activas antiapoptóticas y a las sustancias identificadas por medio de éste. La invención se refiere además a preparados farmacéuticos que contienen tales sustancias, así como a su utilización para el tratamiento de enfermedades vasculares.

La arterioesclerosis (“endurecimiento de las arterias”) es la alteración patológica de las arterias más importante y más frecuente. Se produce aquí una alteración del contenido vascular y lesiones del endotelio (de las células endoteliales) y, provocado por esto, se producen reacciones metabólicas y celulares de la pared vascular. Los trastornos de la irrigación arterial son la causa de muerte más frecuente en los países industrializados (aprox. 50%) . En la mayoría de los casos la causa es una arterioesclerosis.

La efectividad de los medios utilizados actualmente contra las enfermedades cardíacas coronarias se basa sustancialmente en disminuir el consumo de oxígeno del miocardio y adaptarlo a la irrigación coronaria reducida. Estos medios provocan, además, una dilatación de las arterias coronarias. En el caso de estenosis coronarias arterioescleróticas, en cambio, casi no es posible un aumento medicamentoso de la irrigación coronaria porque los vasos enfermos ya no pueden ser dilatados. Todos los medicamentos se administran recién en un estadio muy tardío de la enfermedad. No se conocen hasta ahora agentes que puedan tratar directamente la causa de la enfermedad o que sean adecuados para un reconocimiento temprano. Ante la falta de una posibilidad efectiva para el diagnóstico temprano, la mayoría de los pacientes son tratados recién después de un infarto cardíaco. En el estadio avanzado en la mayoría de los casos sólo es posible una intervención quirúrgica (por ejemplo, bypass) .

Las paredes interiores de todos los vasos sanguíneos están recubiertas con células endoteliales. Éstas participan en la regulación de diversos procesos fisiológicos, como por ejemplo, la regulación de la presión sanguínea y la degradación y la nueva formación de los vasos. Una multiplicidad de situaciones patológicas está ligada con la mala función de las células endoteliales, por ejemplo, el desarrollo focal de la arterioesclerosis.

La apoptosis (sinónimo: muerte celular programada) es un proceso irreversible y no se puede detener. Una célula apoptótica muere por lo tanto inevitablemente.

En la solicitud de patente europea EP-A-0 903 149, se describe un procedimiento para la identificación de sustancias que activan la apoptosis en células inmunológicas. Se ha demostrado que las sustancias que se unen a una proteína asociada a integrina (IAP o CD 47) sobre la superficie de las células inmunológicas pueden tener la capacidad de activar la apoptosis. No se describieron los mecanismos de acción.

Ya se ha propuesto que la IAP participa en la formación de un canal de calcio específico (Schwartz, M. A. et al., The Journal of Biological Chemistr y , 268: 27, 19931-19934) . No se mencionó un papel de este canal de calcio hipotético en la activación de la apoptosis.

En bifurcaciones (ramificaciones) en el sistema vascular, se forman con mayor frecuencia lesiones arterioescleróticas que en zonas no ramificadas de los vasos sanguíneos. En la zona de estas lesiones, ya se pudieron observar células endoteliales apoptóticas. Se comenta una participación de las células endoteliales apoptóticas en la formación de la arterioesclerosis [Asakura, T., Karino, T., Circulation Research, 66, 1045-1066 (1990) .

La publicación de SAMANEN J. et al.: "Vascular indications for integrin av antagonists" CURRENT PHARMACEUTICAL DESIGN, Vol. 3, No. 6, 1997, páginas 545-584, y el documento WO 99/52551 A describen el impedimento de una nueva formación de tejido.

No se conocen actualmente agentes que eviten la aparición de la apoptosis en los endotelios del sistema vascular o para tratarla terapéuticamente.

La presente invención tiene por lo tanto por objeto proveer un procedimiento con el cual se puedan hallar sustancias que inhiban la apoptosis en las células endoteliales. Este procedimiento deberá ser de manipulación sencilla, y seguro y económico en su realización. Las sustancias así identificadas deberán utilizarse como componentes de preparados farmacéuticos para el tratamiento de condiciones en las cuales está indicada una inhibición de la apoptosis, especialmente de la arterioesclerosis.

Este objeto se logra por medio de un preparado farmacéutico con todas las características de la reivindicación 1 así como un uso para la preparación de un medicamento de acuerdo con la reivindicación 3. Formas de realización ventajosas de estos objetos se presentan en las reivindicaciones secundarias 2 y 4.

Sorprendentemente los inventores demostraron que la unión simultánea de trombospondina-1 (TSP-1) a la IAP y a la integrina avß3, en las células endoteliales activa la apoptosis. Además se pudo demostrar sorprendentemente, que la TSP-1 es formada por las propias células endoteliales, es decir, se trata de una apoptosis autoinducida o espontánea.

Estas investigaciones se llevaron a cabo en cultivos celulares estáticos, convencionales. Estos se caracterizan por la falta de flujos en el medio de cultivo celular. Pero se pudo demostrar en forma inesperada, que las células endoteliales en un cultivo de perfusión, es decir, bajo condiciones, en las cuales las células se ven confrontadas con un medio de cultivo celular que fluye, no se forma la TSP-1 y no aparece la apoptosis en este cultivo celular o sólo en medida muy reducida.

Una suplementación de medio fresco con TSP-1 causa un aumento de la apoptosis espontánea en células endoteliales cultivadas estáticamente. Este aumento corresponde aproximadamente al efecto de un medio condicionado estáticamente (es decir, un medio que ya se usó antes durante el cultivo de HUVEC en cultivo estático) (Tabla 1) . Esto muestra que el medio condicionado estáticamente posee la capacidad de inducir la apoptosis a través de un mediador como TSP-1.

El concepto medio "condicionado" significa aquí un medio de cultivo celular, que ya se usó antes para el cultivo de otras células. Este medio se caracteriza porque en él se encuentran disueltos mediadores solubles, por ejemplo, factores de crecimiento hormonal, etc., los que son formados por las células en el transcurso de su cultivo.

Por medio del uso de un anticuerpo anti-TSP-1, el cual se une a la TSP-1 y de este modo la neutraliza, se pudo demostrar que la TSP-1 es el mediador de la apoptosis de las células endoteliales. El efecto de la TSP-1 agregada, así como el efecto de medio condicionado estáticamente puede ser inhibido por medio de un antisuero policlonal agregado contra TSP-1, como también por medio del agregado de un anticuerpo anti-TSP-1 monoclonal (Tabla1) .

Condiciones de cultivo Medio de cultivo (24 hs) Tasa de apoptosis (%)

Estática Medio fresco (a) 0, 9 ± 0, 1

Estática Medio condicionado (b) 3, 0 ± 0, 2

Estática Condicionado + anti TSP-1 (c) 0, 1 ± 0, 1

Estática Fresco + TSP-1 (e) 3, 0 ± 0, 4

Estática Fresco + anti-TSP-1 (d) 0, 2 ± 0, 1

Estática Fresco ´TSP-1 + anti-TSP-1 (f) 0, 2 ± 0, 1

Estática Fresco + mAk TSP-1 (g) 0, 4 ± 0, 1

Tabla 1

La tasa de apoptosis (%) se determinó como se muestra en el Ejemplo 6. Las letras (a) a (g) se refieren a las investigaciones presentadas en el Ejemplo 10 y a las condiciones de ensayo específicas allí seleccionadas (ver Ejemplo 10) .

Además se demostró por medio de los ensayos de Western Blot cualitativamente, que la TSP-1 sólo es segregada por células endoteliales cultivadas estáticamente (Figura 1) . Las tasas de secreción fueron determinadas para cultivos postconfluentes dinámicos y estáticos (Figura 2) . Los resultados mostraron que la inducción de la apoptosis puede ser controlada por medio de la tasa de secreción de la TSP-1.

El concepto “ (condiciones de) cultivo celular estático" significa aquí un cultivo de células bajo condiciones en las cuales no aparecen flujos laminares continuos, es decir, direccionados en forma constante, en el medio celular que rodea a las células. Las "condiciones de cultivo celular estáticas” en el sentido aquí utilizado comprenden aquí también aquellas condiciones de cultivo celular bajo las cuales aparecen flujos laminares turbulentos o discontinuos, es decir, por ejemplo, aquellos que tienen direcciones de flujo cambiantes o incluso con inversión de flujo. El... [Seguir leyendo]

1. Preparado farmacéutico para el tratamiento de la arterioesclerosis, que contiene como componente activo una sustancia activa antiapoptótica, que se une a por lo menos un compuesto seleccionado entre trombospondina-I (TSP-I) , proteína asociada a integrina (IAP) e integrina aVß3 (aVß3) de tal modo que se inhibe la unión simultánea de TSP-1 a IAP y a aVß3, y caracterizado porque la sustancia es seleccionada entre el grupo compuesto por anticuerpos específicos y/o fragmentos de estos, que poseen un sitio de unión al antígeno, contra TSP-1, IAP y/o aVß3.

2. Preparado farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la sustancia activa antiapoptótica se puede identificar de la siguiente manera:

i) se cultivan células que expresan tanto IAP como también la integrina aVß3, ii) se induce a las células a formar una sustancia que induce la apoptosis, y/o se agrega una sustancia o sustancias, que induce/inducen la apoptosis,

iii) se agrega la sustancia de prueba, y iv) se mide la tasa de apoptosis.

3. Uso de una sustancia activa antiapoptótica, que se une a por lo menos un compuesto seleccionado entre trombospondina-1 (TSP-1) , proteína asociada a integrina (IAP) e integrina aVß3 (aVß3) de tal modo que se inhibe la unión simultánea de TSP-1 a IAP y a aVß3, y caracterizado porque la sustancia es seleccionada entre el grupo compuesto por anticuerpos específicos y/o fragmentos de estos, que poseen un sitio de unión al antígeno, contra TSP-1, IAP y/o aVß3 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la arterioesclerosis.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque la sustancia activa antiapoptótica se puede identificar de la siguiente manera:

i) se cultivan células que expresan tanto IAP como también la integrina aVß3, ii) se induce a las células a formar una sustancia que induce la apoptosis, y/o se agrega una sustancia o sustancias, que induce/inducen la apoptosis,

iii) se agrega la sustancia de prueba, y iv) se mide la tasa de apoptosis.