Preparaciones homogéneas de lL-29.

Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con los restos de aminoácidos 1-181 de la SEC ID NO:

4; en el que el resto de aminoácido que corresponde a la cisteína en la posición 171 de la SEC ID NO:4, está sustituido por un resto de serina;

en el que los restos de aminoácidos que corresponden a la cisteína en la posición 15 y en la posición 112 de la SEC ID NO:4 forman un primer enlace disulfuro, y en el que los restos de aminoácidos que corresponden a la cisteína en la posición 49 y en la posición 145 de la SEC ID NO:4 forman un segundo enlace disulfuro, y en el que el polipéptido inhibe la replicación de la hepatitis B o de la hepatitis C.

Preparaciones homogéneas de IL-29

Antecedentes de la invención Las citocinas desempeñan importantes funciones en la regulación de la hematopoyesis y respuestas inmunitarias y pueden influir en el desarrollo de linfocitos. La familia de las citocinas de clase II humana incluye los subtipos interferón ! (IFN-!) , interferón ∀ (IFN-∀) , interferón # (IFN-#) , IL-10, IL-19 (Patente de Estados Unidos 5.985.614) , MDA-7 (Jiang y col., Oncogene 11, 2477-2486, (1995) ) , IL-20 (Jiang y col., Oncogene 11, 2477-2486, (1995) ) , IL-22 (Xie y col., J. Biol. Chem. 275, 31335-31339, (2000) ) y AK-155 (Knappe y col., J. Virol. 74, 3881-3887, (2000) ) . La mayoría de las citocinas se unen y transducen señales a través de cualquiera de los receptores de citocinas de Clase I o Clase II. Los miembros de la familia de receptores de citocinas de clase II humana incluyen interferón-!R1 (IFN-!R1) , interferón-#-R2 (IFN-#-R2) , interferón-# R1 (IFN-# R1) , interferón-#R2 (IFN-#R2) , IL-10R (Liu y col., J. Immunol. 152, 1821-1829, (1994) ) , CRF2-4 (Lutfalla y col. Genomics 16, 366-373, (1993) ) , IL-20Rβ (Blumberg y col., Cell 104, 9-19, (2001) ) (también, conocido como zcytor7 (Patente de Estados Unidos 5.945.511) y CRF2-8 (Kotenko y col., Oncogene 19, 2557-2565, (2000) ) , IL-20R∀ (Blumberg y col., ibid, (2001) ) (también, conocido como DIRS1 (documento PCT WO 99/46379) ) , IL-22RA1 (receptor-!1 de IL-22, presentado al HUGO para su aprobación) (conocido también como IL-22R (Xie y col., J. Biol, Chem. 275, 31335-31339, (2000) ) , zcytor11 (Patente de Estados Unidos 5.965.704) y CRF2-9 (Kotenko y col., Oncogene 19, 2557-2565, (2000) ) y factor tisular.

Los receptores de citocinas de clase II son típicamente heterodímeros compuestos por dos cadenas de receptores distintas, las subunidades de receptor ! y ∀ (Stahl y col., Cell 74, 587-590, (1993) ) . En general, las subunidades ! son las proteínas de unión a citocinas primarias y las subunidades ∀ se requieren para la formación de sitios de unión de alta afinidad, así como para la transducción de señales. Una excepción es el receptor IL-20 en el que ambas subunidades son necesarias para la unión de IL-20 (Blumberg y col., ibid, (2001) ) .

Los receptores de citocina de clase II se identifican por un dominio de unión a citocina conservado de aproximadamente 200 aminoácidos (D200) en la parte extracelular del receptor. Este dominio de unión a citocina está comprendido por dos dominios de fibronectina de tipo III (FnIII) , cada uno con 100 aminoácidos aproximadamente (Bazan J.F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6934-6938, (1990) ; Thoreau y col., FEBS Lett. 282, 1631, (1991) ) . Cada dominio FnIII contiene restos de Cys, Pro y Trp conservados que determinan un patrón de plegamiento característico de siete cadenas ∀ similares a las del dominio constante de las inmunoglobulinas (Uze y col., J. Interferon Cytokine Res. 15, 3-26, (1995) ) . Los elementos estructurales conservados de la familia de receptores de citocinas de clase II hacen posible identificar nuevos miembros de esta familia en base a la homología de secuencias de aminoácidos primarios.

Las interleucinas son una familia de citocinas que median respuestas inmunológicas, incluyendo inflamación. Fundamental para una respuesta inmunitaria es el linfocito T, que produce muchas citocinas y que tiene inmunidad adaptativa contra antígenos. Las citocinas producidas por el linfocito T se han clasificado como de tipo 1 y tipo 2 (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76: 300-317, 1998) . Las citocinas de tipo 1 incluyen IL-2, interferón-gamma (IFN-#) , LT-! y están implicadas en respuestas inflamatorias, inmunidad viral, inmunidad parasitaria intracelular y rechazo de aloinjerto. Las citocinas de Tipo 2 incluyen IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 y están implicadas en respuestas humorales, inmunidad helmíntica y respuestas alérgicas. Las citocinas compartidas entre el Tipo 1 y 2 incluyen IL-3, GM-CSF y TNF-!. Existen algunas pruebas que sugieren que las poblaciones de linfocitos T que producen citocinas de Tipo 1 y Tipo 2 migran preferencialmente al interior de diferentes tipos de tejido inflamado.

De particular interés, desde un punto de vista terapéutico, son los interferones (se proporcionan revisiones de interferones en De Maeyer y De Maeyer-Guignard, “Interferons, ” in The Cytokine Handbook, 3ª Edición, Thompson (ed.) , páginas 491-516 (Academic Press Ltd. 1998) , y Walsh, Biopharmaceuticals. Biochemistr y and Biotechnology, páginas 158-188 (John Wiley & Sons 1998) ) . Los interferones presentan diversas actividades biológicas y son útiles para el tratamiento de determinadas enfermedades autoinmunes, particularmente cánceres y para la mejora de la respuesta inmunitaria contra agentes infecciosos, incluyendo virus, bacterias, hongos y protozoos. Hasta ahora se han identificado seis formas de interferón, que se han clasificado en dos grupos principales. Los IFN denominados de “tipo I” incluyen IFN-!, TFN-∀, IFN-∃, IFN-% e interferón-&. Actualmente, el IFN-# y una subclase de IFN-! son los únicos IFN de tipo II.

Los IFN de tipo I, que se piensa que derivan del mismo gen ancestral, han conservado una estructura similar que es suficiente para actuar mediante el mismo receptor de superficie celular. La cadena ! del receptor IFN-!/∀ humano comprende un dominio extracelular N terminal, que tiene las características de un receptor de citocina de clase II. El IFN-# no comparte homología significativa con el IFN de tipo I o con el subtipo IFN-! de tipo II, pero comparte diversas actividades biológicas con el IFN de tipo I.

Los médicos aprovechan las múltiples actividades de los interferones usando las proteínas para tratar una amplia diversidad de afecciones. Por ejemplo, se ha autorizado una forma de IFN-! para su uso en más de 50 países para el tratamiento de afecciones médicas tales como leucemia de células pilosas, carcinoma de células renales, carcinoma de células basales, melanoma maligno, sarcoma de Kaposi relacionado con el SIDA, mieloma múltiple,

leucemia mielógena crónica, linfoma no Hodgkin, papilomatosis laringea, micosis fungoide, condiloma acuminado, hepatitis crónica B, hepatitis C, hepatitis crónica D y hepatitis crónica no A, no B/C. La Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos ha autorizado el uso del IFN-∀ para tratar esclerosis múltiple, una enfermedad crónica del sistema nervioso. El IFN-# se usa para tratar enfermedades granulomatosas crónicas, en las que el interferón potencia la respuesta inmunitaria del paciente destruyendo bacterias, hongos y protozoos patógenos infecciosos. Los estudios clínicos también indican que el IFN-# puede ser útil en el tratamiento del SIDA, leishmaniasis y lepra lepromatosa.

Las proteínas IL-28A, IL-28B e IL-29 comprenden una nueva familia de proteínas descubierta recientemente que tiene homología de secuencia con los interferones de tipo I y homología genómica con IL-10. Esta nueva familia se describe completamente en la solicitud PCT del mismo propietario que la presente WO 02/086087 y Sheppard y col., Nature Immunol. 4: 63-68, 2003. Funcionalmente, IL-28 e IL-29 se parecen a los IFN de tipo I en cuanto a su capacidad de inducir un estado antiviral en las células pero, a diferencia de los IFN de tipo I, no presentan actividad antiproliferativa contra determinadas líneas de linfocitos B.

Se sabe que IL-28 e IL-29 tienen un número impar de cisteínas (solicitud PCT WO 02/086087 y Sheppard y col., citado anteriormente) . La expresión de IL-28 e IL-29 recombinante puede dar como resultado una mezcla heterogénea de proteínas compuestas por enlaces disulfuro intramoleculares en conformaciones múltiples. La separación de estas formas puede ser difícil y laboriosa. Por lo tanto es deseable proporcionar moléculas de IL-28 e IL-29 que tengan un patrón de enlace disulfuro intramolecular sencillo tras la expresión y procedimientos para el replegamiento y purificación de estas preparaciones para conservar la homogeneidad. Por tanto, la presente memoria descriptiva describe composiciones y procedimientos para producir preparaciones homogéneas de IL-28 e IL-29.

El documento WO 02/086087 describe una familia de proteínas de citocina.

Sheppard P. y col., Nature Immunology, Vol. 4 (1) , enero de 2003, páginas 63-68, describe IL-28, IL-29 y su receptor IL-28R de citocina de clase II.

Rajarathnam K. y col., Biochemistr y , Vol. 38 (24) , 15 de junio 1999, páginas 7653-7658, describen puentes disulfuro en IL-8 investigando usando análogos disulfuro no naturales: Disociación de funciones en estructura a partir de función.

Francis G. E. y col., International Journal of Hematology,... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con los restos de aminoácidos 1-181 de la SEC ID NO:4; en el que el resto de aminoácido que corresponde a la cisteína en la posición 171 de la SEC ID NO:4, está sustituido por un resto de serina; en el que los restos de aminoácidos que corresponden a la cisteína en la posición 15 y en la posición 112 de la SEC ID NO:4 forman un primer enlace disulfuro, y en el que los restos de aminoácidos que corresponden a la cisteína en la posición 49 y en la posición 145 de la SEC ID NO:4 forman un segundo enlace disulfuro, y en el que el polipéptido inhibe la replicación de la hepatitis B o de la hepatitis C.

2. El polipéptido aislado de la Reivindicación 1, en el que el polipéptido tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con los restos de aminoácidos 1-181 de la SEC ID NO:4.

3. El polipéptido aislado de la Reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende adicionalmente una metionina amino-terminal.

4. Un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido de cualquiera de las Reivindicaciones 1-3.

5. Un vector de expresión que comprende los siguientes elementos unidos operativamente:

un promotor de la transcripción un segmento de ADN que codifica el polipéptido de cualquiera de las Reivindicaciones 1-3; y un terminador de la transcripción.

6. Una célula cultivada que comprende el vector de expresión de la Reivindicación 5, en el que la célula expresa el polipéptido codificado por el segmento de ADN.

7. Un procedimiento de producción de un polipéptido que comprende:

cultivar una célula que comprenda el vector de expresión de la Reivindicación 5, en el que la célula expresa el polipéptido codificado por el segmento de ADN; y recuperar el polipéptido expresado.

8. Una formulación que comprende el polipéptido según cualquiera de las Reivindicaciones 1-3, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. Un kit que comprende la formulación de la Reivindicación 8.

10. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con los restos de aminoácidos 1-181 de la SEC ID NO:4, en el que el resto de aminoácido que corresponde a la cisteína en la posición 171 de la SEC ID NO:4 está sustituido por un resto de serina, en el que el polipéptido inhibe la replicación de la hepatitis B o de la hepatitis C; y en el que el polipéptido está pegilado.

11. Un polipéptido aislado de acuerdo con la Reivindicación 10, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con la SEC ID NO:27.

12. Un polipéptido aislado de acuerdo con la Reivindicación 10, en el que dicho polipéptido comprende adicionalmente una metionina amino-terminal.

13. Un polipéptido aislado de acuerdo con la Reivindicación 12, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con la SEC ID NO:29.

14. Un polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 10-13, en el que el polietilenglicol tiene un peso molecular de 20kD.

15. Un polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 10-14, en el que el polietilenglicol está unido al extremo N del polipéptido.

16. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con los restos de aminoácidos 1-181 de la SEC ID NO:4, en el en el que el resto de aminoácido que corresponde a la cisteína en la posición 171 de la SEC ID NO:4 está sustituido por un resto de serina, en el que el polipéptido inhibe la replicación de la hepatitis B o de la hepatitis C; y en el que, para su uso en terapia, el polipéptido está conjugado con un resto polímero soluble en agua farmacéuticamente aceptable.

17. Un polipéptido aislado para su uso de acuerdo con la Reivindicación 16, en el que el resto polímero soluble en agua es polietilenglicol.