Preparación de muestras para CL-EM/EM mediante la utilización de partículas magnéticas.

Un método para purificar un compuesto a partir de una muestra biológica líquida compleja,

dicho compuesto se selecciona a partir del grupo que incluye itraconazol, sirólimus, tacrólimus, everólimus y ácido micofenólico, y dicho método incluye los pasos de (a) poner en contacto la muestra con una cantidad de partículas magnéticas funcionalizadas con una superficie hidrofóbica que se funcionaliza con un grupo alquilo C18, y el compuesto es capaz de interactuar directamente con la superficie hidrofóbica, o capaz de participar en interacciones hidrofóbicas tras la adición de reactivos de apareamiento iónico, y en el que la proporción partículas/muestra es igual o mayor a 1, 25 mg/ml, (b) incubar la muestra y las partículas, adsorbiendo así el compuesto en la superficie hidrofóbica, (c) separar las partículas mediante la aplicación de campos magnéticos y sustraer el líquido, (d) lavar las partículas de manera opcional, (e) eluir el compuesto a partir de las partículas,

caracterizado de manera que en el paso (e) el itraconazol eluye con una mezcla seleccionada a partir del grupo que incluye

(i) una mezcla de 1-9 partes en volumen de acetonitrilo y 1 parte en volumen de ácido fórmico (0, 1% [v/v]), y

(ii) una mezcla de 9 partes en volumen de metanol y 1 parte en volumen de ácido fórmico (0, 1% [v/v]),

y en el paso (e) el sirólimus, el tacrólimus, el everólimus o el ácido micofenólico eluyen con una mezcla de 9 partes en volumen de metanol y 1 parte en volumen de agua.

En una realización particular de la invención la muestra se selecciona a partir del grupo que incluye suero, plasma, sangre total, y sangre hemolizada.

Preparación de muestras para CL-EM/EM mediante la utilización de partículas magnéticas.

La invención hace referencia al campo de la preparación de muestras para la cromatografía líquida junto a la espectrometría de masas en tándem. Particularmente, la invención hace referencia a los procedimientos de preparación adecuados para la detección de ciertas sustancias de bajo peso molecular en muestras biológicas complejas tales como el plasma, el suero o la sangre total.

Antecedentes de la invención La cromatografía líquida (CL) es una técnica analítica extremadamente importante que se utiliza para la separación, la identificación y la cuantificación de un analito de interés, incluso si éste está presente en una mezcla compleja de diferentes constituyentes en la muestra. Durante la CL, los componentes químicos en una mezcla se hacen pasar por una fase estacionaria mediante el flujo de una fase móvil líquida. La separación en la cromatografía líquida se logra mediante las diferencias en las interacciones de los analitos tanto con la fase móvil como con la estacionaria. Tal y como los expertos en la materia apreciarán, deben escogerse tanto una fase móvil como una fase estacionaria apropiadas para los analitos en investigación. Además, el usuario identificará las condiciones cromatográficas apropiadas para mantener la nitidez de las bandas del analito mientras una muestra se mueve a través de la columna de la fase estacionaria hacia el detector.

La cromatografía líquida de alto rendimiento, también conocida como cromatografía líquida de alta presión, y abreviada como HPLC, es una forma especial de cromatografía líquida que, actualmente, se utiliza frecuentemente en bioquímica y química analítica. El analito se fuerza a través de una columna de la fase estacionaria en un líquido (fase móvil) a alta presión, lo que disminuye el tiempo que los componentes separados permanecen en la fase estacionaria y, por consiguiente, el tiempo que tienen que difundir en la columna. Esto lleva a unos picos más estrechos en el cromatograma resultante y, consecuentemente, a una mejor resolución y sensibilidad en comparación con la CL.

La fase móvil se escoge para asegurar la solubilidad de los solutos de la muestra. Preferiblemente, para la fase estacionaria se utiliza sílice microparticulado (puro o modificado químicamente) debido a que su mayor área de superficie acentúa las diferencias en las interacciones entre el soluto y la fase estacionaria. La utilización de una fase estacionaria que interacciona fuertemente con los solutos en relación con las interacciones soluto-fase móvil dará como resultado unos tiempos de retención muy largos, y dicha situación no es útil analíticamente. Por eso, la fase estacionaria debe seleccionarse de manera que proporcione interacciones con el soluto leves-moderadas en relación con las de la fase móvil. Como consecuencia, la naturaleza del soluto gobierna sobre el tipo de CL seleccionada. Las interacciones más fuertes deberían ocurrir en la fase móvil para asegurar la solubilidad de la muestra y su fácil elución, mientras que la fase estacionaria debería responder a diferencias más sutiles entre los solutos. Por ejemplo, los compuestos neutros polares se suelen analizar mejor mediante la utilización de una fase móvil polar junto a una fase estacionaria no polar que distingue entre diferencias sutiles en el carácter dispersivo de los solutos. Uno de los aspectos más potentes de la HPLC es que la fase móvil puede variarse para alterar el mecanismo de retención. Se pueden añadir modificadores a la fase móvil para controlar la retención. Por ejemplo, el pH es una variable importante en las fases móviles acuosas.

Se pueden distinguir cinco clases generales de CL:

1. La cromatografía de fase normal requiere la utilización de una fase estacionaria polar en conjunción con una fase móvil no polar (dispersiva) .

2. La cromatografía de fase reversa, la posibilidad opuesta, requiere la utilización de una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar (compuesta por uno o más disolventes polares, por ejemplo, agua, metanol, acetonitrilo y tetrahidrofurano) .

3. La cromatografía de intercambio iónico involucra las interacciones iónicas. En este caso, la fase móvil debe soportar la ionización para asegurar la solubilidad de los solutos iónicos. La fase estacionaria también debe ser parcialmente iónica para promover cierta retención. Consecuentemente, las interacciones con la fase estacionaria son fuertes, y habitualmente esto se refleja en unos tiempos de análisis más largos y picos más anchos.

4. La cromatografía de exclusión por tamaño involucra unas separaciones basadas sólo en el tamaño molecular e idealmente requiere que no haya interacción energética de los solutos con la fase estacionaria.

5. La cromatografía de afinidad se basa en una interacción específica, por ejemplo, entre los miembros de un par de unión específico, como un antígeno y el anticuerpo correspondiente o un receptor y el ligando correspondiente. Por ejemplo, un primer componente de un par de unión se une a una fase estacionaria apropiada y se utiliza para capturar al segundo componente del par de unión. El segundo componente puede liberarse y asilarse mediante medios apropiados.

La clasificación general de los principios de separación citados con anterioridad no es exhaustiva y, por consiguiente, no es limitante; hay otros principios de separación que pueden utilizarse para la separación de muestras líquidas, por ejemplo, la cromatografía de interacción hidrofóbica, la cromatografía de interacción hidrofílica, la cromatografía de par iónico, y la separación basada en materiales impresos.

El analito de interés puede detectarse mediante cualquier medio apropiado. Los detectores apropiados y adecuados notan la presencia de un compuesto que pasa a través de estos y proporcionan una señal electrónica a un registro o a una estación computerizada de datos. Habitualmente, el resultado se proporciona en forma de cromatograma y se encuentra una sustancia de interés en cierto pico. El área del pico o la altura del pico pueden utilizarse para cuantificar la cantidad del analito presente en la muestra investigada.

El detector para un sistema de HPLC es el componente que emite una respuesta en relación al compuesto de la muestra que se elude y, subsiguientemente, señaliza un pico en el cromatograma. Está colocado inmediatamente después de la fase estacionaria para detectar los compuestos a medida que eluden desde la columna. Habitualmente, la amplitud y la altura de los picos se pueden ajustar mediante la utilización de los controles groseros y finos de sintonización, y el experto en la materia también puede controlar los parámetros de detección y sensibilidad. Existen muchos tipos de detectores que pueden utilizarse en la HPLC. Algunos de los detectores más comunes incluyen: el índice refractivo (IR) , los ultravioleta (UV) , los fluorescentes, los radioquímicos, los electroquímicos, los cercanos al infrarrojo (Near-IR) , la espectrometría de masas (EM) , la resonancia magnética nuclear (RMN) , y la dispersión de luz (LS) .

Los detectores de índice refractivo (RI) miden la capacidad de las moléculas de la muestra de desviar o refractar la luz. Para cada molécula o compuesto, esta propiedad se denomina índice refractivo. En la mayoría de detectores de RI la luz pasa por una cela de flujo bimodular hacia un fotodetector. Un canal de la celda de flujo dirige la fase móvil que pasa a través de la columna mientras que el otro solamente dirige la fase móvil. La detección ocurre cuando la luz se desvía debido a las muestras que eluyen desde la columna, y esto se lee como un disparidad entre los dos canales.

Los detectores fluorescentes miden la capacidad de un compuesto para absorber y luego reemitir la luz a una determinada longitud de onda. Cada compuesto tiene una fluorescencia característica. La fuente de excitación pasa a través de la celda de flujo hacia un fotodetector mientras un monocromador mide la emisión de longitudes de onda.

La detección radioquímica involucra la utilización de material radiomarcado, habitualmente tritio (3H) o carbono-14 (14C) . Funciona mediante la detección de fluorescencia asociada con la ionización de partículas beta, y es la más popular en la investigación de metabolitos.

Los detectores electroquímicos miden compuestos que sufren reacciones de oxidación o reducción. Habitualmente, esto se logra mediante la medición de la ganancia o pérdida de electrones a partir de muestras que migran mientras estas pasan entre electrodos con una determinada diferencia de potencial eléctrico.

La espectrometría... [Seguir leyendo]

1.Un método para purificar un compuesto a partir de una muestra biológica líquida compleja, dicho compuesto se selecciona a partir del grupo que incluye itraconazol, sirólimus, tacrólimus, everólimus y ácido micofenólico, y dicho método incluye los pasos de (a) poner en contacto la muestra con una cantidad de partículas magnéticas funcionalizadas con una superficie hidrofóbica que se funcionaliza con un grupo alquilo C18, y el compuesto es capaz de interactuar directamente con la superficie hidrofóbica, o capaz de participar en interacciones hidrofóbicas tras la adición de reactivos de apareamiento iónico, y en el que la proporción partículas/muestra es igual o mayor a 1, 25 mg/ml, (b) incubar la muestra y las partículas, adsorbiendo así el compuesto en la superficie hidrofóbica, (c) separar las partículas mediante la aplicación de campos magnéticos y sustraer el líquido, (d) lavar las partículas de manera opcional, (e) eluir el compuesto a partir de las partículas,

caracterizado de manera que en el paso (e) el itraconazol eluye con una mezcla seleccionada a partir del grupo que incluye

(i) una mezcla de 1-9 partes en volumen de acetonitrilo y 1 parte en volumen de ácido fórmico (0, 1% [v/v]) , y

(ii) una mezcla de 9 partes en volumen de metanol y 1 parte en volumen de ácido fórmico (0, 1% [v/v]) ,

y en el paso (e) el sirólimus, el tacrólimus, el everólimus o el ácido micofenólico eluyen con una mezcla de 9 partes en volumen de metanol y 1 parte en volumen de agua.

En una realización particular de la invención la muestra se selecciona a partir del grupo que incluye suero, plasma, sangre total, y sangre hemolizada.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la muestra se selecciona a partir del grupo que incluye suero, plasma, sangre total, y sangre hemolizada.