Un proceso para purificar el inhibidor de proteinasa alfa-1 (IPA) a partir de una mezcla no purificada de proteínas que comprende:

a. dispersión de la mezcla no purificada de proteínas que contiene el IPA en un medio acuoso; b. eliminación de una porción de los lípidos y proteínas contaminantes añadiendo a la dispersión acuosa dióxido de silicio como un agente de eliminación de lípidos y la precipitación de la porción de proteínas contaminantes de dicha dispersión acuosa añadiendo polialquilenglicol; c. carga del sobrenadante que contiene IPA del paso (b) en una primera resina de intercambio aniónico con una solución tampón que tenga un pH y una conductividad tales que el IPA quede retenido en la primera resina de intercambio aniónico; d. elución de una fracción que contiene IPA de dicha primera resina de intercambio aniónico con el mismo tipo de tampón que en el paso (c) habiendo ajustado el pH y la conductividad; e. carga de la fracción que contiene IPA del paso (d) en una resina de intercambio catiónico en el mencionado mismo tipo de tampón que tenga un pH y una conductividad apropiados tales que el IPA no quede retenido en la resina de intercambio catiónico; f. recogida del flujo que atraviese del paso (e) que contenga IPA; g. carga de la fracción que contiene IPA del paso (f) en una segunda resina de intercambio aniónico con dicho mismo tipo de tampón que tenga un pH y una conductividad apropiados tales que el IPA se una a la segunda resina de intercambio aniónico; h. elución del IPA de dicha segunda resina de intercambio aniónico con dicho mismo tipo de tampón habiendo ajustado el pH y la conductividad para obtener una solución que contenga IPA activo y purificado.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención hace referencia a un proceso para la purificación del inhibidor de proteinasa alfa-1 (IPA) a partir de una mezcla de proteínas, a las composiciones que constan de ello y el uso de las mismas. Más concretamente, la presente invención hace referencia a un proceso para la purificación a gran escala del IPA del plasma sanguíneo o de fracciones de plasma para obtener un IPA de calidad farmacéutica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Ciertas proteínas del plasma humano útiles a efectos terapéuticos y para otras aplicaciones se pueden obtener únicamente de donaciones de sangre procedentes de varios donantes. La producción recombinante de proteínas del plasma se ve complicada por el hecho de que estas proteínas requieren unos patrones de glicosilación precisos para mantener su función y/o vida media en el cuerpo humano. Por consiguiente, incluso con los riesgos que conlleva de contaminación vírica o de otro tipo, la única fuente disponible homologada de algunas proteínas como por ejemplo el inhibidor de proteinasa alfa-1 es el plasma humano mismo.

El inhibidor de proteinasa alfa-1 (IPA) es un derivado del plasma humano perteneciente a la familia de los inhibidores de serina proteinasa. Es una glicoproteína que tiene un peso molecular medio de 50.600 daltones, producidos por el hígado y segregados al sistema circulatorio. La proteína es una única cadena polipeptídica, a la que varias unidades oligosacáridas están unidas covalentemente. El IPA juega un papel a la hora de controlar la destrucción de tejidos por parte de serina proteinasas endógenas, y es el inhibidor de serina proteinasa más frecuente en el plasma sanguíneo. Entre otras cosas, el IPA inhibe la tripsina, la quimotripsina, varios tipos de elastasas, la colagenasa de la piel, la renina, la uroquinasa y las proteasas de los linfocitos polimorfonucleares.

El IPA se utiliza actualmente terapéuticamente para el tratamiento del enfisema pulmonar en pacientes que tienen una deficiencia genética de IPA. El IPA purificado ha sido homologado como terapia de reemplazo en estos pacientes. El papel normal del IPA es el de regular la actividad de la elastasa leucocitaria, que descompone las proteínas invasoras presentes en el pulmón. Cuando el IPA no está presente en cantidades suficientes para inhibir la actividad de la elastasa, la elastasa descompone el tejido pulmonar. Con el tiempo, este desequilibrio da por resultado el enfisema y daños crónicos en el tejido pulmonar.

El IPA también se propuso como un tratamiento para pacientes homocigotos para los genes reguladores de la conductancia transmembrana (RTFQ) de la fibrosis quística (FQ) defectuosa, que sufren infecciones endobronquiales recurrentes y sinusitis, mala absorción debido a una deficiencia pancreática, enfermedad hepatobiliar obstructiva y reducción de la fertilidad. La principal causa de morbosidad y mortalidad entre pacientes de FQ es las enfermedades pulmonares. El RTFQ regula el transporte de agua y sales en las células epiteliales que cubren las superficies internas y externas del cuerpo. En pacientes con FQ, la proteína del RTFQ está defectuosa debido a una mutación, dando por resultado un transporte defectuoso de agua y sales y la producción de secreciones espesas en varios órganos (por ejemplo, el plumón, el páncreas) .

El defecto de la membrana causado por la mutación del RTFQ lleva a la infección e inflamación crónica pulmonar. La infección crónica de la vía respiratoria inferior provoca una respuesta inflamatoria persistente en las vías respiratorias, dando por resultado una enfermedad crónica obstructiva. A medida que las reservas pulmonares disminuyen, los pacientes con FQ son más propensos a episodios de exacerbación, caracterizados por síntomas de empeoramiento de la infección de la vía respiratoria, en especial por Pseudomonas aeruginosa, acompañada de un agudo deterioro de la función pulmonar. En individuos normales, la elastasa segregada por los neutrófilos en respuesta a la infección es neutralizada por el IPA, que se sabe que penetra en el tejido pulmonar. En pacientes con FQ, sin embargo, la respuesta inflamatoria no regulada sobrecarga el equilibrio normal (del IPA) de proteasa (elastasa) /antiproteasa. El ciclo anómalo es destructivamente autoperpetuante y autoexpandible: la elastasa incrementada lleva al reclutamiento de más neutrófilos en el pulmón, que a su vez segregan proteasas adicionales. Esto lleva a la acumulación de elastasa en el pulmón y a la larga a los daños en los tejidos, la destrucción de la arquitectura pulmonar, la disfunción pulmonar severa y, al final, a la muerte. Se sugiere que el suplemento de IPA adicional puede reducir los efectos nocivos asociados con las cantidades excesivas de elastasa. La demanda de IPA ya excede la disponibilidad del suministro actual, y este problema puede llegar a ser más pronunciado dado que la investigación sugiere usos terapéuticos adicionales para el IPA. Para maximizar el suministro disponible de IPA, un proceso para purificar el IPA a partir del plasma humano debería tener el mayor rendimiento posible, y también se deberían considerar fuentes alternativas. Por consiguiente, se requieren medios más eficientes de aislamiento, adecuados para la producción a gran escala de buena práctica de fabricación (BPF) .

Varios grupos han informado de la producción de IPA recombinante. (Por ejemplo, G. Wright et al., Biotechnology, Vol. 9, pp. 830-834 (1991) ; A.L. Archibald et al., Proc. Nat´1. Acad. Sci. EE.UU., Vol. 87, pp. 51785182 (1990) ) . Sin embargo, por el momento, el plasma humano es la única fuente homologada de IPA terapéutico.

Se han descrito varios métodos de purificación del IPA a partir de plasma humano. La mayoría de estos métodos están dirigidos al aislamiento a escala de laboratorio mientras que otros corresponden a la producción a nivel comercial. Se han revelado varios métodos de aislamiento, por ejemplo en la patente estadounidense nº 4.379.087 y la nº 5.610.285. Muchos de los primeros métodos empleaban una precipitación de sulfato de amonio del plasma humano seguida por diálisis, empleando además un paso cromatográfico en DEAE-celulosa. Sin embargo, los métodos descritos para la diálisis no se pueden aplicar fácilmente a la purificación a gran escala, y son procesos largos y que llevan mucho tiempo con probabilidad de comprometer la actividad de la proteína aislada.

Una purificación a gran escala del IPA a partir de plasma humano fue revelada por Kress et al., (Preparative Biochem., 3:541-552, 1973) . El precipitado del tratamiento de sulfato de amonio al 80% del plasma humano fue sometido a diálisis y al cromatógrafo en DEAE-celulosa. El concentrado obtenido fue sometido de nuevo a diálisis y filtrado en gel en SEPHADEX™ G-100. Las fracciones que contenían IPA fueron sometidas al cromatógrafo dos veces en DE-52 celulosa para dar IPA.

Glaser et al., (Preparative Biochem., 5:333-348, 1975) aislaron el IPA de la pasta IV-1 de la fracción de Cohn. En este método, la fracción IV-1 disuelta fue sometida al cromatógrafo en DEAE-celulosa, QAE-SEPHADEX™, concanavalina-A-SEPHA-ROSE™, y SEPHADEX™ -G-150 para dar IPA. Sin embargo, Glaser et al. únicamente consiguieron un 30% de rendimiento total a partir de la pasta IV-1 de la fracción.

Podiarene et al., (Vopr. Med. Khim. 35:96-99, 1989) informaron de un procedimiento de un solo paso para el asilamiento de IPA a partir de plasma humano utilizando cromatografía de afinidad con anticuerpos monoclonales. La actividad específica del IPA se multiplicó por 61, 1 con un rendimiento de solamente el 20% a partir del plasma.

Burnouf et al., (Vox. Sang. 52:291-297, 1987) comenzando con el efluente II+III de la fracción de Cohn utilizaron cromatografía DEAE y cromatografía de exclusión por tamaños para producir un IPA puro al 80-90% (por SDS-PAGE) con una recuperación del 65-70% a partir de este efluente.

Hein et al., (Eur. Respir. J. 9:16s-20s, 1990) presentaron un proceso que emplea la pasta IV-1 de la fracción de Cohn como el material de inicio y utilizaron la precipitación fraccional con polietilenglicol seguida de cromatografía de intercambio aniónico en DEAE-Sefarosa™. El producto final posee una pureza de alrededor del 60% con un rendimiento del 45% a partir de la pasta IV-1.

Dubin et al., (Prep. Biochem. 20:63-70, 1990) utilizaron una purificación cromatográfica en dos pasos según la cual el alfa-Pl, el inhibidor-C1, la alfa-1 antiquimotripsina, y el inhibidor de alfa-1 tripsina... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para purificar el inhibidor de proteinasa alfa-1 (IPA) a partir de una mezcla no-urificada de proteínas que comprende:

a. dispersión de la mezcla no purificada de proteínas que contiene el IPA en un medio acuoso;

b. eliminación de una porción de los lípidos y lipotreínas contaminantes mediante la adición a la dispersión acuosa de dióxido de silicio como un agente de eliminación de lípidos y la precipitación de la porción de proteínas contaminantes de dicha dispersión acuosa mediante la adición de polialquilenglicol;

c. carga del sobrenadante que contiene IPA del paso (b) en una primera resina de intercambio aniónico con una solución tampón que tenga un pH y una conductividad tales que el IPA quede retenido en la primera resina de intercambio aniónico;

d. elución de una fracción que contiene IPA de dicha primera resina de intercambio aniónico con el mismo tipo de tampón que en el paso (c) habiendo ajustado el pH y la conductividad;

e. carga de la fracción que contiene IPA del paso (d) en una resina de intercambio catiónico en el mencionado mismo tipo de tampón que tenga un pH y una conductividad apropiados tales que el IPA no quede retenido en la resina de intercambio catiónico;

f. recogida del flujo que atraviese del paso (e) que contenga IPA;

g. carga de la fracción que contiene IPA del paso (f) en una segunda resina de intercambio aniónico con dicho mismo tipo de tampón que tenga un pH y una conductividad apropiados tales que el IPA se una a la segunda resina de intercambio aniónico;

h. elución del IPA de dicha segunda resina de intercambio aniónico con dicho mismo tipo de tampón habiendo ajustado el pH y la conductividad para obtener una solución que contenga IPA activo y purificado.

2. El proceso de la reivindicación 1, en el que el IPA obtenido comprende al menos un 90% de IPA activo del total de IPA recuperado, preferentemente en el que el IPA obtenido comprende al menos un 95% de IPA activo del total de IPA recuperado; o en el que la solución de IPA comprende al menos un 90% de IPA del total de proteínas recuperadas;

preferentemente en el que el IPA obtenido comprende al menos un 95% de IPA del total de proteínas recuperadas; o en el que la solución tampón es una que no sea un tampón con base de citrato; o en el que la solución tampón es un tampón con base de acetato; o que además comprende un paso de eliminación vírica, preferentemente, en el que el paso de eliminación vírica comprende la nanofiltración; o en el que la mezcla no purificada de proteínas es seleccionada del grupo que consta de fracciones de Cohn, plasma sanguíneo humano y fracciones de plasma; preferentemente en el que la mezcla no purificada de proteínas es la pasta IV de la fracción de Cohn; o en el que la primera y segunda resina de intercambio aniónico es una resina de DEAE-Sefarosa; o en el que la resina de intercambio catiónico es una resina de Carboximetil-Sefarosa; o en el que el pH de la solución tampón tiene un pH de entre 5, 5 y 6, 5 para la elución del IPA a partir de la primera y segunda resina de intercambio aniónico.

3. El proceso de la reivindicación 1, que además comprende un paso de inactivación vírica.

4. El proceso de la reivindicación 3,

en el que el paso de inactivación vírica comprende la adición de un disolvente y un detergente al IPA del paso (f) recogido de la resina de intercambio catiónico, preferentemente en el que el detergente es un detergente no iónico.

5. El proceso de la reivindicación 1, en el que el polialquilenglicol es polietilenglicol; o en el que la precipitación se lleva a cabo con un pH de desde alrededor de 5, 0 a alrededor de 6, 5.

6. El proceso de la reivindicación 1, que además comprende el cambio de la composición iónica de la solución que contiene IPA activo y purificado para que contenga un ión compatible fisiológicamente y la esterilización de la solución resultante.

7. El proceso de la reivindicación 6, en el que la solución que contiene IPA se concentra antes del intercambio iónico; o en el que el ión fisiológicamente compatible es seleccionado del grupo que consta de un ión de fosfato, un ión de

cloruro y combinaciones de los mismos.