Predicción de pronóstico para aplicación relacionada con cáncer colorrectal.

Un método para determinar el pronóstico de CCR en un paciente,

que comprende las etapas de:

(i) determinar el nivel de expresión de mARN de dos o más marcadores de pronóstico de cáncer colorrectal (CCPMs) de una firma de pronóstico, en donde los dos o más CCPM incluyen al menos DLGAP4 y opcionalmente uno o más genes adicionales de la Tabla 1 y 2, en una muestra tumoral de CCR del paciente,

(ii) comparar dicho nivel de expresión de los CCPM en la firma de pronóstico con los niveles de expresión de los CCPM en muestras de cáncer recurrente y no recurrente, y

(iii) establecer un pronóstico, en donde si una muestra de tumor de un paciente muestra un aumento en la expresión de DLGAP4, en comparación con la expresión en muestras de cáncer no recurrente, se indica una probabilidad aumentada de recurrencia de CCR después del tratamiento estándar,

y en donde si la muestra de tumor muestra una ausencia de un aumento en la expresión de DLGAP4, en comparación con la expresión en muestras de cáncer no recurrente, se indica una probabilidad disminuida de recurrencia de CCR después del tratamiento estándar.

Predicción de pronóstico para aplicación relacionada con cáncer colorrectal

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Patente de Nueva Zelanda Núm. 544432, presentada el 23 de diciembre de 2005.

Campo de la invención Esta invención se refiere a métodos para determinar el pronóstico de cáncer colorrectal en un paciente. Específicamente, esta invención se refiere al uso de marcadores genéticos para determinar el pronóstico de cáncer colorrectal en base a firmas de pronóstico.

Antecedentes de la invención El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres más comunes en el mundo desarrollado, y su incidencia continua creciendo. Aunque la progresión del cáncer colorrectal desde pólipo benigno a adenoma a carcinoma está bien estudiada (1) , los sucesos moleculares que influyen la transición y establecimiento de metástasis se entienden peor. El pronóstico y tratamiento de CCR depende actualmente de la etapa clinico-patológica de la enfermedad en el momento del diagnóstico, y el tratamiento quirúrgico primario. Desafortunadamente la etapa de la enfermedad por sí sola no permite la predicción exacta del resultado para pacientes individuales. Si los resultados del paciente pudieran predecirse de forma más exacta los tratamientos podrían adecuarse para evitar el infra-tratamiento de los pacientes destinado a la recaída, o el sobre-tratamiento de los pacientes que se podrían ayudar solo por cirugía.

Se han hecho muchos intentos para identificar marcadores que predicen el resultado clínico en CCR. Hasta hace poco la mayoría de los estudios se enfocaban a proteínas sencillas o mutaciones génicas con éxito limitado en términos de información de pronóstico (2) . La tecnología de micromatrices permite la identificación de conjuntos de genes, denominados clasificadores o firmas que correlacionan con el resultado de cáncer. Esta aproximación se ha aplicado a una variedad de cánceres, que incluyen CCR (3-5) , aunque problemas metodológicos y una falta de validación independiente han puesto en duda los descubrimientos (6, 7) . Además, han surgido dudas sobre la capacidad de los clasificadores/firmas para predecir el resultado debido a la pobre concordancia de los identificados por diferentes investigadores que usan diferentes plataformas de matrices y metodologías (8) .

Hay una necesidad de herramientas adicionales para predecir el pronóstico de cáncer colorrectal. Esta invención proporciona métodos adicionales, composiciones, equipos y dispositivos basados en marcadores de pronóstico de cáncer, específicamente marcadores de pronóstico de cáncer colorrectal, para ayudar en el pronóstico y tratamiento del cáncer.

Di Pietro et al (Gastroenterology, Vol. 129, Sep 2005, páginas 1047-1059) describe que la reparación incompatible de ADN defectuoso determina un perfil transcripcional característico en cánceres de colon proximales. El documento XP002355386 describe el Conjunto de Matrices U133 de Genoma Humano de chip génico Affymetrix HG-U133A. El documento WO 02/06867 describe métodos de diagnóstico de cáncer colorrectal metastático, composiciones y métodos de barrido para moduladores de cáncer colorrectal metastático. El documento WO 2004/090550 describe un método para la detección de cáncer colorrectal en muestras humanas. Gao et al (Chinese Journal of Clinical Rehabilitation, Vol. 9, Ene 2005, páginas 228-229) describe la importancia evaluativa de la expresión del antígeno Fas y la proteína P53 en el cáncer colorrectal para los caracteres biológicos y pronóstico. El documento WO 2005/064009 describe la clasificación de cáncer. Lin et al (Journal of Sichuan University, Medical Science Edition, Julio 2005, Vol. 36, Núm. 4, págs. 503-505) describe la expresión e importancia clínica de nm23-H1, Fas y FasL en tejidos de carcinoma colorrectal.

Explicación de la invención Se describe en esta memoria un conjunto de genes marcadores identificados por expresarse de forma diferencial en tumores colorrectales recurrentes y no recurrentes. Este conjunto de genes pueden usarse para generar firmas de pronóstico, que comprenden dos o más marcadores, capaces de predecir la progresión de tumor colorrectal en un paciente.

Los marcadores individuales pueden expresarse de forma diferencial dependiendo de si el tumor es recurrente o no. La exactitud de predicción puede mejorarse combinando los marcadores juntos en una firma de pronóstico, proporcionando ensayos individuales mucho más efectivos que los ensayos de gen único. También se describen en esta memoria la aplicación de técnicas, tales como estadísticas, aprendizaje automático, inteligencia artificial y extracción de datos a las firmas de pronóstico para generar modelos de predicción. Los niveles de expresión de los marcadores de una firma de pronóstico particular en el tumor de un paciente pueden aplicarse entonces al modelo de predicción para determinar el pronóstico.

Como se describe en esta memoria, el nivel de expresión de los marcadores puede establecerse usando métodos de micromatrices, reacción de cadena polimerasa cuantitativa (qPCR) .

La invención proporciona un método para determinar el pronóstico de CCR en un paciente, que comprende las etapas de:

(i) determinar el nivel de expresión de mARN de dos o más marcadores de pronóstico de cáncer colorrectal (CCPM) de una firma de pronóstico, en donde los dos o más CCPM incluyen al menos DLGAP4 y opcionalmente uno o más genes adicionales de la Tabla 1 y 2, en una muestra de tumor de CCR del paciente,

(ii) comparar dicho nivel de expresión de los CCPM en la firma de pronóstico a los niveles de expresión de los CCPM en muestras de cáncer recurrente y no recurrente, y

(iii) establecer un pronóstico, en donde si una muestra tumoral de un paciente muestra un aumento en la expresión de DLGAP4, en comparación con la expresión en muestras de cáncer no recurrente, se indica una probabilidad aumentada de recurrencia de CCR después del tratamiento estándar,

y en donde si la muestra tumoral muestra una ausencia de un aumento en la expresión de DLGAP4, en comparación con la expresión en muestras de cáncer no recurrente, se indica una probabilidad disminuida de recurrencia de CCR después del tratamiento estándar.

En realizaciones preferidas el método de la invención comprende la detección de expresión de ME2 usando una o más sondas Affymetrix: 210154_at, 210153_s_at y 209397_at, y/o la detección de expresión de DLGAP4 usando la sonda Affymetrix 202570_s_at, y/o la detección de FAS usando una o más de las sondas Affymetrix; 215719_x_at, 216252_x_at, 204780_s_at y 204781_s_at.

Breve descripción de las figuras Esta invención se describe con referencia a realizaciones específicas de la misma y con referencia a las figuras, en que:

La Figura 1 representa un diagrama de flujo que muestra la metodología para producir las firmas de pronóstico de 149 muestras de cáncer colorrectal (CCR) de Nueva Zelanda (NZ) y 55 de Alemania (DE) . Las muestras de ARN de Nueva Zelanda se hibridaron a matrices de dos canales de oligonucleótidos, con una firma de 22 genes producida por medio de validación cruzada dejando uno fuera (LOOCV) , y después validadas independientemente por LOOCV usando el conjunto de datos de DE de 55 muestras. Las muestras de ARN alemán se hibridaron a matrices Affymetrix, con una firma de 19 genes producida por medio de LOOCV, y después se validaron independientemente por LOOCV usando el conjunto de datos de NZ.

La Figura 2 representa un análisis de Kaplan-Meier del tiempo de supervivencia libre de enfermedad con pacientes predichos como de riesgo alto frente a bajo de recurrencia de tumor: a, usando la firma de 22 genes de NZ en 149 tumores de pacientes de NZ; a, usando la firma de 19 genes de DE en 55 tumores de pacientes de DE; c, firma de pronóstico de NZ validada en 55 tumores de pacientes de DE; d, firma de pronóstico de DE validada en 149 tumores de pacientes de NZ; los valores P se calcularon usando el ensayo de rango logarítmico.

La Figura 3 representa un análisis de Kaplan-Meier del tiempo de supervivencia libre de enfermedad con pacientes predichos como de riesgo alto frente a bajo de recurrencia de tumor: a, usando la firma de NZ de 22 genes en pacientes de NZ con enfermedad en Etapa II y Etapa III; b, usando la firma de DE de 19 genes en pacientes de NZ con enfermedad en Etapa II y Etapa III.

La Figura 4 muestra el valor predictivo de firmas de longitudes variables para el pronóstico de cáncer colorrectal. Estas firmas se derivaron de 10 marchas de replicado de validación cruzada de 11 iteraciones. Cada marcha de validación de 11 iteraciones de replicado se indica por las diversas... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar el pronóstico de CCR en un paciente, que comprende las etapas de:

(i) determinar el nivel de expresión de mARN de dos o más marcadores de pronóstico de cáncer colorrectal (CCPMs) de una firma de pronóstico, en donde los dos o más CCPM incluyen al menos DLGAP4 y opcionalmente uno o más genes adicionales de la Tabla 1 y 2, en una muestra tumoral de CCR del paciente,

(ii) comparar dicho nivel de expresión de los CCPM en la firma de pronóstico con los niveles de expresión de los CCPM en muestras de cáncer recurrente y no recurrente, y

(iii) establecer un pronóstico, en donde si una muestra de tumor de un paciente muestra un aumento en la expresión de DLGAP4, en comparación con la expresión en muestras de cáncer no recurrente, se indica una probabilidad aumentada de recurrencia de CCR después del tratamiento estándar,

y en donde si la muestra de tumor muestra una ausencia de un aumento en la expresión de DLGAP4, en comparación con la expresión en muestras de cáncer no recurrente, se indica una probabilidad disminuida de recurrencia de CCR después del tratamiento estándar.

2. El método según la reivindicación 1, en donde la firma comprende adicionalmente uno o más genes seleccionados de las Tablas 1 y 2.

3. El método según la reivindicación 1, en donde la firma se selecciona de la Tabla 9.

4. El método según la reivindicación 1, en donde la firma es la firma 151 o 205 de la Tabla 9.

5. El método según la reivindicación 1, en donde dicha etapa de comparación de dichos niveles de expresión de los CCPM en la firma de pronóstico implica el uso de un método estadístico seleccionado del grupo que consiste en modelos lineales, máquinas de vector de soporte, redes neurales, árboles de clasificación y regresión, métodos de aprendizaje en conjunto, análisis discriminatorio, método de vecino más próximo, redes bayesianas, análisis de componentes independientes.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la expresión de cada CCPM se detecta usando una o más sondas Affymetrix para ese CCPM.

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se usan en la detección de la expresión de cada CCPM a partir de las Tablas 1 y 2, una o más sonda (s) Affymetrix correspondiente (s) de la Tabla 1 y 2.

8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los dos o más CCPM incluyen ME2 y la expresión de ME2 se detecta usando una o más de las sondas Affymetrix; 210154_at, 210153_s_at y 209397_at.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa de determinación del nivel de expresión de los genes en la firma de pronóstico se realiza detectando el nivel de expresión de cADN de cada gen.

10. El método según la reivindicación 9, en donde la etapa de determinación del nivel de expresión de los genes en la firma de pronóstico se realiza usando un nucleótido complementario a al menos una parte de dicho cADN.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa de determinación del nivel de expresión de los genes en la firma de pronóstico se realiza usando un método de qPCR que usa un cebador directo y un cebador inverso.

12. El método según la reivindicación 11, en donde la etapa de determinación del nivel de expresión de los genes en la firma de pronóstico se realiza usando un dispositivo, comprendiendo el dispositivo:

un sustrato que tiene una o más posiciones en él, teniendo cada posición dos o más oligonucleótidos en ella, que incluye DLGAP4.

13. El método según la reivindicación 1, en donde la expresión de DLGAP4 se detecta usando la sonda Affymetrix; 202570_s_at.

14. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los dos o más CCPM incluyen FAS y la expresión de FAS se detecta usando una o más de las sondas Affymetrix; 215719_x_at, 216252_x_at, 204780_s_at y 204781_s_at.

FIG. 1

Predicción de clase Predicción de clase

FIG. 2

FIG. 3

FIG. 4

FIG. 5

C

FIG. 6

Número de apariciones en la lista de los 100 primeros

FIG. 7

Número de apariciones en la lista de los 100 primeros.