Polipéptidos que tienen actividad de alfa-glucuronidasa y polinucleótidos que codifican los mismos.

Polipéptido aislado con actividad de alfa-glucuronidasa, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos con al menos 5 un 85%, preferiblemente al menos un90%, y de la forma más preferible al menos un 95% de identidad con el polipéptido maduro de SEC ID n.º:2;

(b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibridiza bajo al menos condiciones de astringencia altísimascon (i) la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEC ID n.º:1, (ii) secuencia de ADN genómico quecomprende la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.º:1, o (iii) una cadena complementaria entoda su longitud a (i) o (ii);

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un85%, preferiblemente al menos un 90%, y de la forma más preferible al menos un 95% de identidad con la secuenciacodificante del polipéptido maduro de SEC ID n.º: 1.

Polipéptidos que tienen actividad de alfa-glucuronidasa y polinucleótidos que codifican los mismos Antecedentes de la invención

Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de alfa-glucuronidasa y polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huésped que comprenden los polinucleótidos al igual que métodos de producción y utilización de los polipéptidos.

Antecedentes [0002] Los polisacáridos de pared celular vegetal constituyen el 90% de la pared celular vegetal y se pueden dividir en tres grupos: celulosa, hemicelulosa, y pectina. Celulosa representa el constituyente principal de los polisacáridos de la pared celular. Hemicelulosas son el segundo constituyente más abundante de paredes celulares vegetales. El principal polímero de hemicelulosa es xilano. La estructura de los xilanos encontrados en paredes celulares de plantas puede diferir significativamente dependiendo de su origen, pero siempre contienen un esqueleto de d-xilosa beta-1, 4-enlazado. El esqueleto de d-xilosa beta-1, 4-enlazado se puede sustituir por varios grupos laterales, tal como L-arabinosa, Dgalactosa, acetilo, feruloil, p-cumaroil, y residuos de ácido glucurónico.

La hidrólisis completa de la hemicelulosa requiere la acción de un complejo de enzimas incluyendo acetilxilano esterasas, ácido ferúlico esterasas, xilanasas, arabinofuranosidasas, xilosidasas y alfa-glucuronidasa. Alfaglucuronidasa es la enzima que es responsable de la hidrólisis del enlace alfa-1, 2-glicosídico entre xilosa y ácido Dglucurónico o su 4-O-metil éter.

Es un objeto de la presente invención proporcionar polipéptidos nuevos con actividad de alfa-glucuronidasa adecuados para el uso en procesos industriales, por ejemplo, en procesos que comprenden conversión de biomasa celulósica en productos útiles incluyendo etanol.

Una alfa-glucuronidasa de Aureobasidium pullulans siendo 67, 3% idéntica ha sido descrita por de Wet et al. (Enzyme Microb. Technol. 38:649-656, 2006)

Resumen de la invención [0006] La presente invención se refiere a alfa-glucuronidasas, y en particular a alfa-glucuronidasas con una secuencia de aminoácidos homóloga a o idéntica a la alfa-glucuronidasa derivada de Penicillium aurantiogriseum y descritas en la SEC ID n.º:2.

En un primer aspecto la presente invención proporciona un polipéptido aislado con actividad de alfaglucuronidasa, seleccionado del grupo consistiendo en:

(a) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos con al menos un 85%, preferiblemente al menos un 90%, y de la forma más preferible al menos un 95% de identidad con el polipéptido maduro de SEC ID n.º:2;

(b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibridiza bajo al menos condiciones de astringencia altísimas con

(i) la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEC ID n.º:1, (ii) Secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEC ID n.º:1, o (iii) una cadena complementaria en toda su longitud de

(i) o (ii) ;

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 85%, preferiblemente al menos un 90%, y de la forma más preferible al menos un 95% de identidad con la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEC ID n.º:1

En un segundo aspecto la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido del primer aspecto.

En un tercer aspecto la presente invención proporciona un constructo de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido del segundo aspecto operativamente enlazado a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión.

En un cuarto aspecto la presente invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos del tercer aspecto.

En un quinto aspecto la presente invención proporciona una célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos del tercer aspecto.

En un sexto aspecto la presente invención proporciona un método para producir el polipéptido del primer aspecto, que comprende: (a) cultivo una célula, que en su forma tipo salvaje produce el polipéptido, bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

En un séptimo aspecto la presente invención proporciona un método para producir el polipéptido del primer aspecto, que comprende: (a) cultivo de una célula huésped que comprende un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

En un octavo aspecto la presente invención proporciona un método para producir el polipéptido del primer aspecto, que comprende: (a) cultivo una planta transgénica o una célula de planta que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

En un noveno aspecto la presente invención proporciona un método de planta transgénica, parte de planta o célula vegetal transformada con un polinucleótido que codifica el polipéptido del primer aspecto.

En un décimo aspecto la presente invención proporciona un método para producir una proteína, que comprende:

(a) cultivar la célula huésped recombinante del aspecto quinto bajo condiciones propicias para la producción de la proteína; y (b) recuperación la proteína.

En un undécimo aspecto la presente invención proporciona un método para degradar o convertir un material de biomasa, que comprende tratar el material con el polipéptido del primer aspecto.

En un duodécimo aspecto la presente invención proporciona una composición que comprende el polipéptido del primer aspecto, y una o más enzima (s) seleccionada (s) de acetilxilano esterasa, ácido ferúlico esterasa, xilanasa, arabinofuranosidasa y xilosidasa.

En un décimo tercer aspecto la presente invención proporciona un uso del polipéptido del primer aspecto o la composición del duodécimo aspecto en un proceso para la hidrólisis de un material de biomasa que comprende poner en contacto dicha biomasa con dicho polipéptido o dicha composición.

Definiciones [0020] Actividad de alfa-glucuronidasa: el término "actividad de alfa-glucuronidasa" es definido aquí como una actividad EC 3.2.1.139 que cataliza la reacción alfa-D-glucuronosida + H2O = un alcohol + D-glucuronato. Para fines de la presente invención, la actividad de alfa-glucuronidasa se determina según el procedimiento descrito por de Vries (J.Bacteriol, 1998, Vol. 180, p. 243-249) . Una unidad de actividad de alfa-glucuronidasa iguala la cantidad de enzima capaz de liberar 1 micromol de ácido glucurónico o 4-O-metilglucurónico por min bajo las condiciones de ensayo estándar descritas en la sección titulada "Determinación de la actividad de alfa-glucuronidasa".

Los polipéptidos de la presente invención tienen como mínimo un 20%, preferiblemente al menos un 40%, más preferiblemente al menos un 50%, más preferiblemente al menos un 60%, más preferiblemente al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 80%, incluso más preferiblemente al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e incluso de la forma más preferible al menos un 100% de la actividad de alfa-glucuronidasa del polipéptido maduro de SEC ID n.º:2.

Polipéptido aislado: el término "polipéptido aislado" como se usa aquí se refiere a un polipéptido que está aislado de una fuente. En un aspecto preferido, el polipéptido es al menos 1% puro, preferiblemente al menos 5% puro, más preferiblemente al menos 10% puro, más preferiblemente al menos 20% puro, más preferiblemente al menos 40% puro, más preferiblemente al menos 60%, puro incluso más preferiblemente al menos 80% puro, y de la forma más preferible al menos 90% puro, como se determina por SDS-PAGE.

Polipéptido sustancialmente puro: el término "polipéptido sustancialmente puro" denota aquí una preparación de polipéptido que contiene como mucho un 10%, preferiblemente como mucho un 8%, más preferiblemente como mucho un 6%, más preferiblemente como mucho un 5%, más preferiblemente como mucho un 4%, más preferiblemente como mucho un 3%, incluso más preferiblemente como mucho un 2%, de la forma más preferible como mucho un 1%, e incluso de... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido aislado con actividad de alfa-glucuronidasa, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos con al menos un 85%, preferiblemente al menos un 90%, y de la forma más preferible al menos un 95% de identidad con el polipéptido maduro de SEC ID n.º:2;

(b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibridiza bajo al menos condiciones de astringencia altísimas con (i) la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEC ID n.º:1, (ii) secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.º:1, o (iii) una cadena complementaria en toda su longitud a (i) o (ii) ;

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 85%, preferiblemente al menos un 90%, y de la forma más preferible al menos un 95% de identidad con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.º: 1.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.º:2 o un fragmento de la misma que tiene actividad de alfa-glucuronidasa.

3. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende o consiste en el polipéptido maduro de SEC ID n.º:2.

4. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se codifica por un polinucleótido que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEC ID n.º:1 o una subsecuencia de la misma que codifica un fragmento con actividad de alfa-glucuronidasa.

5. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se codifica por un polinucleótido que comprende o consiste en la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEC ID n.º:1.

6. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el polipéptido maduro consiste en los aminoácidos 1 a 835 de SEC ID n.º:2.

7. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la secuencia codificante de polipéptido maduro consiste en los nucleótidos 1 a 2508 de SEC ID n.º:1.

8. Polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Constructo de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido según la reivindicación 8 operativamente enlazado a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión.

10. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 9.

11. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 9.

12. Método para producir el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende: (a) cultivo de una célula, que en su forma tipo salvaje produce el polipéptido, bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

13. Método para producir el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende: (a) cultivo de una célula huésped que comprende un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

14. Método para producir el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende: (a) cultivo una planta o una célula de planta transgénica que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

15. Planta transgénica, parte de planta o célula vegetal transformada con un polinucleótido que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

16. Método para producir una proteína, que comprende: (a) cultivo de la célula huésped recombinante de la reivindicación 11 bajo condiciones propicias para la producción de la proteína; y (b) recuperación la proteína.

17. Método para degradar o convertir un material de biomasa, que comprende tratar el material con el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

18. Método según la reivindicación 17, que comprende además tratar el material de biomasa que comprende grupos feruloil con una enzima seleccionada del grupo que consiste en una xilanasa, una arabinofuranosidasa, una xilosidasa, una glucuronidasa, y una combinación de las mismas.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, donde el material de biomasa es un pienso para animales.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, donde el material de biomasa es una biomasa celulósica.

21. Composición que comprende el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y una o más enzima (s) 10 seleccionada (s) de acetilxilano esterasa, ácido ferúlico esterasa, xilanasa, arabinofuranosidasa y xilosidasa.

22. Uso del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o la composición según la reivindicación 21 en un proceso para la hidrólisis de un material de biomasa que comprende poner en contacto dicha biomasa con dicho polipéptido o dicha composición.

23. Uso según la reivindicación 22 en un proceso para producir etanol.

24. Uso según la reivindicación 22 en un proceso para producir pienso para animales.