Polipéptidos relacionados con el copolímero 1 para su uso como marcadores de pesos moleculares y para uso terapéutico.

Un procedimiento para preparar un producto farmacéutico que comprende acetato de glatirámero que tiene un peso molecular medio de desde 4.

000 hasta 13.000 Daltons, procedimiento que comprende las etapas de obtener una preparación de acetato de glatirámero;

determinar el peso molecular medio de la preparación de acetato de glatirámero usando un aparato cromatográfico que se calibra usando una pluralidad de marcadores de pesos moleculares para establecer una relación lineal entre el tiempo de retención de los marcadores de pesos moleculares en el aparato cromatográfico y el log del peso molecular de los marcadores de pesos moleculares, en el que cada uno de los marcadores de pesos moleculares es un polipéptido que consiste en alanina, ácido glutámico, tirosina y lisina y que tiene una secuencia de aminoácidos predeterminada y un peso molecular definido;

y usar la preparación de acetato de glatirámero para preparar el producto farmacéutico si la preparación de acetato de glatirámero tiene un peso molecular medio de desde 4.000 hasta 13.000 Daltons.

Polipéptidos relacionados con el copolímero 1 para su uso como marcadores de pesos moleculares y para uso terapéutico

Introducción La presente invención proporciona marcadores de pesos moleculares para la determinación precisa del peso molecular del acetato de glatirámero, de terpolímeros y otros copolímeros. Los marcadores de pesos moleculares son polipéptidos que tienen pesos moleculares identificados entre aproximadamente 2000 Daltons y aproximadamente 40.000 Daltons, y una composición de aminoácidos que se corresponde con el acetato de glatirámero o con un copolímero relacionado. Los pesos moleculares identificados se proporcionan mediante polipéptidos que tienen secuencias definidas. Los marcadores de pesos moleculares que se corresponden con el acetato de glatirámero comprenden los aminoácidos alanina, ácido glutámico, tirosina y lisina en relaciones molares específicas. Los marcadores de pesos moleculares correspondientes a terpolímeros relacionados comprenden tres de los cuatro aminoácidos. En una forma de realización preferida, el polipéptido tiene alanina en el extremo Nterminal y tirosina en la cuarta posición desde el extremo N-terminal. La presente invención proporciona adicionalmente una pluralidad de marcadores de pesos moleculares para la determinación del intervalo de pesos moleculares de una composición copolimérica. La pluralidad de marcadores de pesos moleculares idealmente presenta relaciones lineales entre la elipticidad molar y el peso molecular, o entre el tiempo de retención y el log del peso molecular.

Óptimamente, los polipéptidos demuestran actividad biológica similar al copolímero del que se derivan. Polipéptidos que tienen pesos moleculares definidos y composiciones de aminoácidos similares a acetato de glatirámero tienen óptimamente utilidad terapéutica para el tratamiento de estados y enfermedades inmunitarias.

Antecedentes de la invención Las enfermedades autoinmunitarias se producen cuando el sistema inmunitario de un organismo no puede reconocer algunos de los propios tejidos del organismo como “suyos” y los ataca como foráneos. Normalmente, se desarrolla autotolerancia de manera temprana por acontecimientos del desarrollo dentro del sistema inmunitario que impiden que las propias células T y células B del organismo reaccionen con los propios tejidos del organismo. Estas respuestas inmunitarias tempranas están mediadas por la unión de antígenos a moléculas del CMH y presentación a receptores de células T.

Este proceso de autotolerancia falla cuando se desarrollan enfermedades autoinmunitarias y los propios tejidos y proteínas del organismo se reconocen como “autoantígenos” y se atacan por el sistema inmunitario del organismo. Por ejemplo, se cree que la esclerosis múltiple es una enfermedad autoinmunitaria que se produce cuando el sistema inmunitario ataca la vaina de mielina, cuya función es aislar y proteger los nervios. Es una enfermedad progresiva caracterizada por desmielinización, seguido por pérdida de función motora y neuronal. También se cree que la artritis reumatoide (“AR”) es una enfermedad autoinmunitaria que implica inflamación crónica de las articulaciones sinoviales e infiltración por células T activadas, macrófagos y células plasmáticas, conduciendo a una destrucción progresiva del cartílago articular. Es la forma más grave de enfermedad de las articulaciones. La naturaleza del/de los autoantígeno (s) atacado (s) en la artritis reumatoide se entiende escasamente, aunque el colágeno de tipo II es un candidato.

Se hereda una tendencia a desarrollar esclerosis múltiple y artritis reumatoide. Estas enfermedades se producen más frecuentemente en individuos que portan uno o más alelos de CMH de clase II característicos. Por ejemplo, la susceptibilidad heredada a la artritis reumatoide está fuertemente asociada con los alelos de CMH de clase II DRB1 *0401, DRB 1 *0404, o DRB 1*0405 o el DRB1*0101. Los antígenos de locus de histocompatibilidad (HLA) se encuentran en la superficie de las células y ayudan a determinar la individualidad de tejidos de diferentes personas. Los genes para los antígenos de locus de histocompatibilidad están ubicados en la misma región del cromosoma 6 que el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) . La región del CMH expresa varias clases distintivas de moléculas en diversas células del cuerpo, siendo los genes, en orden de secuencia a lo largo del cromosoma, los genes de CMH de clase I, II y II. Los genes de clase I consisten en genes de HLA, que se subdividen adicionalmente en las subregiones A, B y C. Los genes de clase II se subdividen en las subregiones DR, DQ y DP. Las moléculas CMH-CR son las mejor conocidas; éstas se producen en las superficies de células presentadoras de antígenos tales como macrófagos, células dendríticas de tejido linfoide y células epidérmicas. Los productos de CMH de clase III se expresan en diversos componentes del sistema del complemento, así como en algunas células no relacionadas con el sistema inmunitario.

Se han desarrollado varios agentes terapéuticos para tratar enfermedades autoinmunitarias, incluyendo fármacos antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, por ejemplo, metotrexato; diversos interferones; y determinados inhibidores de la síntesis de prostaglandinas. Sin embargo, estos agentes pueden ser tóxicos cuando se usan durante periodos de tiempo más que cortos o provocan efectos secundarios no deseados. Otros agentes terapéuticos se unen a y/o inhiben la actividad inflamatoria del factor de necrosis tumoral (TNF) , por ejemplo, anticuerpos específicos anti-TNF o fragmentos de anticuerpo, o una forma soluble del receptor de TNF. Estos agentes seleccionan como diana una proteína en la superficie de una célula T e impiden generalmente la interacción con una célula presentadora de antígeno (CPA) . Sin embargo, composiciones terapéuticas que contienen proteínas plegadas naturales son a menudo difíciles de producir, formular, almacenar y administrar. Además, la heterogeneidad innata del sistema inmunitario puede limitar la eficacia de los fármacos y complicar el tratamiento a largo plazo de enfermedades autoinmunitarias.

El acetato de glatirámero (copolímero 1; Cop 1; a continuación en el presente documento copolímero GLAT) es una mezcla de polipéptidos compuestos por alanina, ácido glutámico, lisina y tirosina en una relación molar de aproximadamente 4, 6:1, 5:3, 0:1, 0, respectivamente, que se sintetiza polimerizando químicamente los cuatro aminoácidos, formando productos con pesos moleculares medio que oscilan entre aproximadamente 4000 y aproximadamente 13.000 daltons. Las fracciones molares correspondientes son aproximadamente 0, 427 para alanina, 0, 141 para ácido glutámico, 0, 337 para lisina y 0, 093 para tirosina, y pueden variar en aproximadamente +/-10%. Copolímeros relacionados son mezclas de polipéptidos compuestos por tres (por tanto, “terpolímeros”) de los cuatro aminoácidos mencionados anteriormente. El copolímero 1 y los terpolímeros abordan la heterogeneidad innata del sistema inmunitario de mamíferos y la población humana y son eficaces para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y otros estados inmunitarios. Se describen intervalos de pesos moleculares medio preferidos y procedimientos de preparación de terpolímeros en la patente estadounidense n.º 5.800.808. También se contemplan por la invención otros copolímeros compuestos por otras combinaciones de tres, cuatro o cinco o más aminoácidos.

Para certificar una preparación de terpolímero o copolímero 1 para su uso en productos farmacéuticos, es necesario determinar con precisión la distribución de pesos moleculares de los polipéptidos en la preparación. Un método para determinar el peso molecular es la cromatografía en una columna de Superosa 12. Se han determinado coeficientes de calibración de columnas para la determinación del peso molecular del acetato de glatirámero usando lotes de acetato de glatirámero con pesos moleculares medidos indirectamente. Las medidas indirectas han incluido viscosimetría y ultracentrifugación de velocidad de sedimentación. Más recientemente, se han preparado lotes de marcadores de acetato de glatirámero cuyos pesos moleculares se determinaron mediante dispersión de luz láser multiángulo (MALLS) .

Por tanto, existe una necesidad de marcadores de pesos moleculares útiles como patrones para determinar la distribución de pesos moleculares de composiciones de copolímeros contempladas por la invención. Los marcadores de pesos moleculares deseables tienen pesos moleculares definidos y propiedades físicas que son análogas a las moléculas para las que va a determinarse el peso molecular, idealmente, hay una relación lineal... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para preparar un producto farmacéutico que comprende acetato de glatirámero que tiene un peso molecular medio de desde 4.000 hasta 13.000 Daltons, procedimiento que comprende las etapas de obtener una preparación de acetato de glatirámero;

determinar el peso molecular medio de la preparación de acetato de glatirámero usando un aparato cromatográfico que se calibra usando una pluralidad de marcadores de pesos moleculares para establecer una relación lineal entre el tiempo de retención de los marcadores de pesos moleculares en el aparato cromatográfico y el log del peso molecular de los marcadores de pesos moleculares, en el que cada uno de los marcadores de pesos moleculares es un polipéptido que consiste en alanina, ácido glutámico, tirosina y lisina y que tiene una secuencia de aminoácidos predeterminada y un peso molecular definido;

y usar la preparación de acetato de glatirámero para preparar el producto farmacéutico si la preparación de acetato de glatirámero tiene un peso molecular medio de desde 4.000 hasta 13.000 Daltons.

2. Un procedimiento para certificar acetato de glatirámero para su uso en un producto farmacéutico que comprende acetato de glatirámero que tiene un peso molecular medio de desde 4.000 hasta 13.000 Daltons, procedimiento que comprende las etapas de determinar el peso molecular medio del acetato de glatirámero usando un aparato cromatográfico que se calibra usando una pluralidad de marcadores de pesos moleculares para establecer una relación lineal entre el tiempo de retención de los marcadores de pesos moleculares en el aparato cromatográfico y el log del peso molecular de los marcadores de pesos moleculares, en el que cada uno de los marcadores de pesos moleculares es un polipéptido que consiste en alanina, ácido glutámico, tirosina y lisina y que tiene una secuencia de aminoácidos predeterminada y un peso molecular definido; y

certificar el acetato de glatirámero para su uso en el producto farmacéutico si el acetato de glatirámero tiene un peso molecular medio de desde 4.000 hasta 13.000 Daltons.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que en los marcadores de pesos moleculares la fracción molar de alanina es de 0, 38 a 0, 5, de ácido glutámico es de 0, 13 a 0, 15, de tirosina es de 0, 08 a 0, 10 y de lisina es de 0, 3 a 0, 4.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que en los marcadores de pesos moleculares la fracción molar de alanina es de 0, 422 a 0, 444, de ácido glutámico es de 0, 133 a 0, 143, de tirosina es de 0, 086 a 0, 093 y de lisina es de 0, 333 a 0, 349.

5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el aparato cromatográfico es una columna de cromatografía en gel permeable.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el aparato cromatográfico es una columna TSK, una columna de Sephadex, una columna de Sepharosa o una columna de Superosa.

7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que uno de los marcadores de pesos moleculares es:

AKKYAKKEKAAKKAYKKEAKAKAAEAAAKEAAYEA (SEQ ID NO: 1) ;

AKKYAKKAKAEKAKKAYAAEAKKAAKYEKAAAEKAAAKEAAYEA (SEQ ID NO: 2) ; en los que A representa alanina, K representa lisina, Y representa tirosina y E representa ácido glutámico.

8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la pluralidad de marcadores de pesos moleculares es:

AKKYAKKEKAAKKAYKKEAKAKAAEAAAKEAAYEA (SEQ ID NO: 1) ; AKKYAKKAKAEKAKKAYKAAEAKKAAKYEKAAAEKAAAKEAAYEA (SEQ ID NO: 2) ;

en los que A representa alanina, K representa lisina, Y representa tirosina y E representa ácido glutámico.

Distribución de L-alanina en los marcadores TV

FIGURA 1a-1

L-alanina FIGURA 1a-2