Métodos para la producción de polipéptidos en mutantes de Fusarium venenatum deficientes en enzimas.
Método para producir un polipéptido, que comprende:
(a) cultivo de un mutante de una cepa madre de Fusarium venenatum en un medio para la producción del polipéptido,
donde la cepa mutante comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido y pyrG, amyA y alpA, donde pyrG, amyA y alpA se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa amilasa y proteasa alcalina, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas; y
(b) recuperación del polipéptido del medio de cultivo.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2009/059039.
Solicitante: NOVOZYMES, INC..
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 1445 DREW AVENUE DAVIS, CA 95618 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: SHASKY,JEFFREY, YODER,WENDY.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/80 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para hongos.
PDF original: ES-2538790_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Métodos para la producción de polipéptidos en mutantes de Fusarium venenatum deficientes en enzimas
Referencia a un listado de secuencias 5
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Antecedentes de la invención 10
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos de producción de polipéptidos en cepas mutantes de Fusarium venenatum deficientes en enzimas, cepas mutantes de Fusarium venenatum deficientes en enzimas y métodos de 15 obtención de las cepas mutantes de Fusarium venenatum deficientes en enzimas.
Descripción de las técnicas relacionadas
Fusarium venenatum ha demostrado ser útil como célula huésped para la producción recombinante de 20 polipéptidos con actividad biológica (WO 96/00787, WO 97/26330) . Los huéspedes de Fusarium venenatum con los rasgos deseables de expresión y secreción de proteína aumentados pueden no tener necesariamente las características más deseables para la fermentación exitosa. La fermentación puede no ser óptima debido a la producción de sustancias biológicas, por ejemplo, enzimas, perjudiciales para la producción, recuperación, o solicitud de un polipéptido de interés en particular. 25
El documento WO 99/60137 divulga mutantes de Fusarium venenatum deficientes en tricoteceno. El documento WO 00/42203 divulga mutantes de Fusarium venenatum deficientes en ciclohexadopsipéptidos.
El documento WO9812300 divulga especies de Fusarium para la expresión génica heteróloga que están 30 modificadas genéticamente para expresar niveles reducidos de una proteasa alcalina mediante mutaciones del gen alp.
La presente invención se refiere a huéspedes de Fusarium venenatum mejorados que combinan la capacidad de la expresión de cantidades comerciales de un polipéptido de interés mientras son deficientes en la producción de 35 enzimas que pueden complicar la recuperación y el siguiente procesamiento del polipéptido.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a métodos de producción de un polipéptido, que comprenden: 40
1. (a) cultivo de un mutante de una cepa madre de Fusarium venenatum en un medio para la producción del polipéptido, donde la cepa mutante comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido y pyrG, amyA y alpA, donde pyrG, amyA y alpA se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa-amilasa y proteasa alcalina, respectivamente, en comparación con la cepa madre 45 de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas; y 2. (b) recuperación del polipéptido del medio de cultivo.
En un aspecto de los métodos de producción de un polipéptido, la cepa mutante comprende además uno o ambos de los genes tri5 y dps1, donde el primero o ambos de los genes se modifican provocando la deficiencia de la 50 cepa mutante en la producción de una o ambas enzimas tricodieno sintasa y ciclohexadepsipéptido sintetasa, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas.
La presente invención también se refiere a mutantes de una cepa madre de Fusarium venenatum, que 55 comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido y pyrG, amyA y alpA, donde pyrG, amyA y alpA se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa amilasa y proteasa alcalina, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas.
En un aspecto, los mutantes de una cepa madre de Fusarium venenatum comprenden además uno o ambos de los genes tri5 y dps1, donde el primero o ambos de los genes se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de una o ambas enzimas tricodieno sintasa y ciclohexadepsipéptido sintetasa, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas. 65
La presente invención también se refiere a métodos para obtener un mutante de una cepa madre de Fusarium venenatum, que comprende:
1. (a) la modificación de pyrG, amyA y alpA; y 2. (b) la identificación de una cepa mutante del paso (a) donde pyrG, amyA y alpA se modifican provocando la 5 deficiencia de la cepa mutante en la producción de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa amilasa y proteasa alcalina, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas.
Preferiblemente, en los aspectos de la invención, el polipéptido es nativo o foráneo a la cepa de Fusarium 10 venenatum.
En un aspecto, los métodos de obtención de mutantes de una cepa madre de Fusarium venenatum comprenden además la modificación de uno o ambos de los genes tri5 y dps1 que dejan la cepa mutante deficiente en la producción de una o ambas enzimas tricodieno sintasa y ciclohexadepsipéptido sintetasa, respectivamente, en 15 comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra un mapa de restricción de pDM156.2.
La Figura 2 muestra un mapa de restricción de pEmY21.
La Figura 3 muestra un mapa de restricción de pEmY23.
La Figura 4 muestra un mapa de restricción de pWTY1470-19-07. 25
La Figura 5 muestra un mapa de restricción de pWTY1515-2-01.
La Figura 6 muestra un mapa de restricción de pJaL504-[Bam HI].
La Figura 7 muestra un mapa de restricción de pJaL504-[Bgl II].
La Figura 8 muestra un mapa de restricción de pJaL574.
La Figura 9 muestra un mapa de restricción de pWTY1449-02-01. 30
La Figura 10 muestra un mapa de restricción de pJfyS1540-75-5.
La Figura 11 muestra un mapa de restricción de pJfyS1579-1-13.
La Figura 12 muestra un mapa de restricción de pJfyS1579-8-6.
La Figura 13 muestra un mapa de restricción de pJfyS1579-21-16.
La Figura 14 muestra un mapa de restricción de pAILo1492-24. 35
La Figura 15 muestra un mapa de restricción de pJfyS1579-35-2.
La Figura 16 muestra un mapa de restricción de pJfyS1579-41-11.
La Figura 17 muestra un mapa de restricción de pJfyS1604-55-13.
La Figura 18 muestra un mapa de restricción de pJfyS1579-93-1.
La Figura 19 muestra un mapa de restricción de pJfyS1604-17-2. 40
La Figura 20 muestra un mapa de restricción de pEJG61.
La Figura 21 muestra un mapa de restricción de pEJG69.
La Figura 22 muestra un mapa de restricción de pEJG65.
La Figura 23 muestra un mapa de restricción de pMStr19.
La Figura 24 muestra un mapa de restricción de pEJG49. 45
La Figura 25 muestra un mapa de restricción de pEmY15.
La Figura 26 muestra un mapa de restricción de pEmY24.
La Figura 27 muestra un mapa de restricción de pDM257.
La Figura 28 muestra un mapa de restricción de pDM258.
La Figura 29 muestra que la oxidasa de lactosa produce transformantes de Fusarium venenatum JfyS 1643-95-04 50 (tri5 pyrG amyA) .
La Figura 30 muestra la actividad de alfa amilasa relativa de transformantes de transformantes de Fusarium venenatum JfyS1643-95-04 (tri5 pyrG amyA) .
La Figura 31 muestra un mapa de restricción de pJfyS1698-65-15.
La Figura 32 muestra un mapa de restricción de pJfyS1698-72-10. 55
La Figura 33 muestra la actividad de proteasa alcalina relativa de transformantes de Fusarium venenatum JfyS1763-11-01 (tri5 pyrG amyA alpA) .
La Figura 34 muestra un mapa de restricción de pJfyS1879-32-2.
La Figura 35 muestra un mapa de restricción de pJfyS111.
Definiciones
Orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa: el término "orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa" se define aquí como una ligasa UTP:amonio (formación de ADP) (EC 6.3.4.2) que cataliza la conversión del ATP + UTP + NH3 a ADP + fosfato + CTP. Para fines de la presente invención, la actividad de la orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa 65 se determina según el método descrito por Liberman, 1956, Journal of Biological Chemistr y 222: 765-775) .
Alfa amilasa: el término "alfa amilasa" se define aquí como un 1, 4--D-glucano glucanohidrolasa (EC 3.2.1.1) que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1, 4--D-glucosídicos en polisacáridos que contienen tres o más unidades D-glucosa unidas a 1, 4-. Para fines de la presente invención, la actividad de la alfa amilasa se determina usando el 4, 6-etilideno... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Método para producir un polipéptido, que comprende:
(a) cultivo de un mutante de una cepa madre de Fusarium venenatum en un medio para la producción del 5 polipéptido, donde la cepa mutante comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido y pyrG, amyA y alpA, donde pyrG, amyA y alpA se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa amilasa y proteasa alcalina, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas; y (b) recuperación del polipéptido del medio de cultivo. 10
2. Método según la reivindicación 1, donde la cepa mutante comprende además uno o ambos de los genes tri5 y dps1, donde el uno o ambos de los genes se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de una o ambas enzimas tricodieno sintasa y ciclohexadepsipéptido sintetasa, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas. 15
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el polipéptido es nativo o foráneo a la cepa de Fusarium venenatum.
4. Mutante de una cepa madre de Fusarium venenatum, que comprende un polinucleótido que codifica un 20 polipéptido y pyrG, amyA y alpA, donde pyrG, amyA y alpA se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa amilasa y proteasa alcalina, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas.
5. Cepa mutante según la reivindicación 4, que comprende además uno o ambos de los genes tri5 y dps1, donde el uno o ambos de los genes se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de una o ambas enzimas tricoodieno sintasa y ciclohexadepsipéptido sintetasa, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas.
6. Cepa mutante según cualquiera de las reivindicaciones 4-5, donde el polipéptido es nativo o foráneo a la cepa de Fusarium venenatum.
7. Método para obtener un mutante de una cepa madre de Fusarium venenatum, que comprende:
(a) modificación de pyrG, amyA y alpA; y (b) identificación de una cepa mutante del paso (a) donde pyrG, amyA y alpA se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa amilasa y proteasa alcalina, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas. 40
8. Método según la reivindicación 7, que comprende además la modificación de uno o ambos de los genes tri5 y dps1, provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de una o ambas enzimas tricodieno sintasa y ciclohexadepsipéptido sintetasa, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas. 45
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