POLIPEPTIDOS ANTIMICROBIANOS.
Polipéptido con actividad antimicrobiana, que comprende la secuencia de aminoácidos:
G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-Z;
donde
donde
y donde los aminoácidos que componen los polipéptidos son independientemente seleccionados de formas D o L
Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W04000400DK.
Solicitante: NOVOZYMES ADENIUM BIOTECH A/S.
Nacionalidad solicitante: Dinamarca.
Dirección: KROGSHOEJVEJ 36,2880 BAGSVAERD.
Inventor/es: MYGIND, PER, HOLSE, SEGURA, DOROTEA, RAVENTOS, HOEGENHAUG,HANS-HENRIK,KRISTENSEN, TOSSI,ALESSANDRO.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 14 de Octubre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A01N37/46 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01N CONSERVACION DE CUERPOS HUMANOS O ANIMALES O DE VEGETALES O DE PARTES DE ELLOS (conservación de alimentos o productos alimenticios A23 ); BIOCIDAS, p. ej. EN TANTO QUE SEAN DESINFECTANTES, PESTICIDAS O HERBICIDAS (preparaciones de uso médico, dental o para el aseo que eliminan o previenen el crecimiento o la proliferación de organismos no deseados A61K ); PRODUCTOS QUE ATRAEN O REPELEN A LOS ANIMALES; REGULADORES DEL CRECIMIENTO DE LOS VEGETALES. › A01N 37/00 Biocidas, productos que atraen o repelen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen compuestos orgánicos que tienen un átomo de carbono que posee tres enlaces a heteroátomos, con a lo más dos enlaces a un halógeno, p. ej. ácidos carboxílicos (conteniendo ácidos ciclopropanocarboxílicos o sus derivados, p. ej. nítrilos de ácidos ciclopropanocarboxílicos, A01N 53/00). › Derivados N-acilados.
- A23K1/165B
- A23K1/16B
- A23K1/16G
- A23K1/17
- A23K1/175J
- A23K1/18
- A23K1/18L2
- A23K1/18S
- C07K14/00B
- C07K14/47 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de mamíferos.
- C11D3/00B13
- C11D3/37B8
- C11D3/38 C […] › C11 ACEITES, GRASAS, MATERIAS GRASAS O CERAS ANIMALES O VEGETALES; SUS ACIDOS GRASOS; DETERGENTES; VELAS. › C11D COMPOSICIONES DETERGENTES; UTILIZACION DE UNA SOLA SUSTANCIA COMO DETERGENTE; JABON O SU FABRICACION; JABONES DE RESINA; RECUPERACION DE LA GLICERINA. › C11D 3/00 Otros compuestos que entran en las composiciones detergentes cubiertas por C11D 1/00. › Productos de composición no bien definida.
Clasificación PCT:
- A01H5/00 A01 […] › A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS. › Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica.
- A23K1/17
- A61K38/16 A […] › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Péptidos que tienen más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados.
- A61P31/04 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES. › A61P 31/00 Antiinfecciosos, es decir antibióticos, antisépticos, quimioterápicos. › Agentes antibacterianos.
- C07K14/00 C07K […] › Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados.
- C07K14/47 C07K 14/00 […] › de mamíferos.
- C11D3/00 C11D […] › Otros compuestos que entran en las composiciones detergentes cubiertas por C11D 1/00.
- C12N15/11 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
Clasificación antigua:
- A01H5/00 A01H […] › Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica.
- A23K1/17
- A61K38/16 A61K 38/00 […] › Péptidos que tienen más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados.
- A61P31/04 A61P 31/00 […] › Agentes antibacterianos.
- C07K14/00 C07K […] › Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados.
- C07K14/47 C07K 14/00 […] › de mamíferos.
- C11D3/00 C11D […] › Otros compuestos que entran en las composiciones detergentes cubiertas por C11D 1/00.
- C12N15/11 C12N 15/00 […] › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
Fragmento de la descripción:
Polipéptidos antimicrobianos.
Antecedentes
En los últimos años, la variedad de agentes antimicrobianos ha aumentado sustancialmente, con un aumento paralelo en microorganismos patógenos resistentes. La resistencia ahora es reconocida frente a todos los agentes antimicrobianos clínicamente disponibles. La respuesta a la resistencia antimicrobiana en la comunidad médica ha sido usar antibióticos nuevos o alternativos no usados previamente contra las bacterias resistentes. Este enfoque ha requerido el desarrollo continuo de antibióticos nuevos, bien como modificaciones de compuestos existentes actualmente o como combinaciones de compuestos que pueden inhibir o eludir los mecanismos de resistencia bacteriana.
WO 01/12668 expone péptidos antimicrobianos truncados, que están basados en SMAP29 y RCAP18, pero que contienen una cantidad inferior de residuos de aminoácidos que aún así retienen actividad bactericida. Además, se describen los péptidos sintéticos basados en la proteína SMAP 29 que tienen menos residuos de aminoácidos e incluyen sustituciones.
WO 96/09322 expone el uso de PR-39 y derivados de los mismos, al igual que otra prolina y péptidos antimicrobianos ricos en arginina, colectivamente denominados "sinducinas", en la modulación de cicatrización de heridas.
Tossi et al. "Identification and characterization of a primary antibacterial domain in CAP18, a lipopolysaccharide binding protein from rabbit leukocytes", FEBS Left, Vol. 339 (1-2), 108-112 (1994) expone estudios de predicción de estructura secundaria en CAP18, que identificaron una secuencia de 21 residuos altamente catiónicos con la tendencia a adoptar una conformación alfahelicoidal amfipática, como se observa en muchos péptidos antimicrobianos.
Tossi et al. "Design of synthetic antimicrobial peptides based on sequence analogy and amphipathicity", Eur J Biochem, Vol. 250 (2), 549-558 (1997) expone péptidos antimicrobianos alfa helicoidales, que fueron concebidos comparando las secuencias N-terminales de muchos de estos péptidos de insecto, rana y familias de mamíferos, extrayendo características comunes y creando patrones de secuencias con los cuales diseñar péptidos activos.
Tossi et al. "Amphipathic, alpha-helical antimicrobial peptides", Biopolymers, Vol. 55 (1), 4-30 (2000) expone un análisis comparativo de muchas secuencias peptídicas antimicrobianas alfa-helicoidales y proporciona información adicional sobre cómo estos parámetros están distribuidos e interrelacionados.
Es un objeto de la presente invención proporcionar polipéptidos nuevos que tengan actividad antimicrobiana mejorada y polinucleótidos que codifiquen los polipéptidos.
Resumen
En un primer aspecto la invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana, que comprende la secuencia de aminoácidos:
donde
donde
En un segundo aspecto la presente invención se refiere a polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la invención.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un constructo de ácidos nucléicos que comprenden la secuencia de nucleótidos, que codifica el polipéptido de la invención, operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en el huésped adecuado.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucléicos de la invención.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucléicos de la invención.
En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de un polipéptido de la invención. El método comprendiendo:
- (a) cultivo de una célula huésped recombinante de la invención bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y
- (b) recuperación del polipéptido.
Otros aspectos de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción a continuación y de las reivindicaciones anexas.
Definiciones
Antes de discutir la presente invención en más detalle, se definirán primero los siguientes términos y convenciones:
Actividad antimicrobiana: el témino "actividad antimicrobiana" es definido en la presente como una actividad que es capaz de matar células microbianas o de inhibir su crecimiento. En el contexto de la presente invención, el término "antimicrobiano" significa que hay un efecto bactericida y/o bacteriostático y/o fungicida y/o fungistático y/o un efecto virucida, donde el término "bactericida" debe ser entendido como capaz de matar células bacterianas. El término "bacteriostático" debe ser entendido como capaz de inhibir el crecimiento bacteriano, es decir, inhibir las células bacterianas en crecimiento. El término "fungicida" debe ser entendido como capaz de matar células fúngicas. El término "fungistático" debe ser entendido como capaz de inhibir el crecimiento fúngico, es decir, de inhibir las células fúngicas en crecimiento. El término "virucida" debe ser entendido como capaz de inactivar virus. El término "células microbianas" denota células bacterianas o fúngicas (incluidas las levaduras).
En el contexto de la presente invención, la expresión "inhibir el crecimiento de células microbianas" se utiliza para significar que las células están en el estado de no crecimiento, es decir, que éstas no son capaces de propagarse.
Para los fines de la presente invención, la actividad antimicrobiana puede ser determinada según el procedimiento descrito por Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, vol. 137 (2) págs. 167-174 (1991).
Los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana pueden ser capaces de reducir la cantidad de células vivas de Escherichia coli (DSM 1576) a 1/100 después de 8 horas (preferiblemente después de 4 horas, más preferiblemente después de 2 horas, de forma más preferible después de 1 hora, y en particular después de 30 minutos) de incubación a 20ºC en una solución acuosa de 25%(p/p); preferiblemente en una solución acuosa de 10%(p/p); más preferiblemente en una solución acuosa de 5%(p/p); incluso más preferiblemente en una solución acuosa de 1%(p/p); de forma más preferible en una solución acuosa de 0,5%(p/p); y en particular en una solución acuosa de 0,1%(p/p) de los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana.
Los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana también pueden ser capaces de inhibir la excrecencia de Escherichia coli (DSM 1576) durante 24 horas a 25ºC en un sustrato de crecimiento microbiano, cuando se añade en una concentración de 1000 ppm; preferiblemente cuando se añade en una concentración de 500 ppm; más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 250 ppm; incluso más preferiblemente, cuando se añade en una concentración de 100 ppm; de forma más preferible, cuando se añade en una concentración de 50 ppm; y en particular, cuando se añade en una concentración de 25 ppm.
Los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana pueden ser capaces de reducir la cantidad de células vivas de Bacillus subtilis (ATCC 6633) a 1/100 después de 8 horas (preferiblemente después de 4 horas, más preferiblemente después de 2 horas, de forma más preferible después de 1 hora, y en particular después de 30 minutos) de incubación a 20ºC en una solución acuosa de 25%(p/p); preferiblemente en una solución acuosa de 10%(p/p); más preferiblemente en una solución acuosa de 5%(p/p); incluso más preferiblemente en una solución acuosa de 1%(p/p); de forma más preferible en una solución acuosa de 0,5%(p/p); y en particular en una solución acuosa de 0,1%(p/p) de los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana.
Los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana también pueden ser capaces de inhibir la excrecencia de Bacillus subtilis (ATCC 6633)...
Reivindicaciones:
1. Polipéptido con actividad antimicrobiana, que comprende la secuencia de aminoácidos:
donde
donde
y donde los aminoácidos que componen los polipéptidos son independientemente seleccionados de formas D o L.
2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos, como lo expone la SEC ID NO:58,
donde
3. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos, como se expone en la SEC ID NO:2,
donde
4. Polipéptido según la reivindicación 1, que consiste en los aminoácidos 1 a 29 de la SEC ID NO:2 o aminoácidos 1 a 19 de la SEC ID NO:58.
5. Polinucleótido que tiene una secuencia de nucleóidos que codifica el polipéptido definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. Constructo de ácidos nucléicos que comprenden la secuencia de nucleátidos definida en la reivindicación 5 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped adecuado.
7. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucléicos definido en la reivindicación 6.
8. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucléicos definido en la reivindicación 6.
9. Método para la producción de un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4, el método comprendiendo:
(a) cultivo de una célula huésped recombinante tal y como se define en la reivindicación 8 bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y
(b) recuperación del polipéptido.
10. Composición que comprende un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
11. Composición según la reivindicación 10, que además comprende un agente biocida adicional.
12. Método, que no es un método para el tratamiento terapéutico del cuerpo humano o animal, para matar o inhibir el crecimiento de células microbianas comprendiendo la puesta en contacto de las células microbianas con un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
13. Composición de detergente que comprende un tensioactivo y un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
14. Polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para el uso como un medicamento.
15. Polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para el uso como un agente antimicrobiano terapéutico o profiláctico veterinario o humano.
16. Uso de un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para el uso en la preparación de un agente terapéutico veterinario o humano para el tratamiento de una infección microbiana o para uso profiláctico.
17. Planta transgénica, parte de planta o célula vegetal, que ha sido transformada con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad antimicrobiana tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
18. Uso de al menos un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en alimento para animales.
19. Uso de al menos un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en la preparación de una composición para el uso en alimento para animales.
20. Aditivo de alimento para animales que comprende
(a) al menos un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4; y
(b) al menos una vitamina soluble en grasa, y/o
(c) al menos una vitamina soluble en agua, y/o
(d) al menos un oligoelemento, y/o
(e) al menos un macromineral.
21. Aditivo de alimento para animales según la reivindicación 20, que además comprende fitasa, xilanasa, galactanasa, y/o beta glucanasa.
22. Composición de alimento para animales que tiene un contenido bruto de proteína de 50 a 800 g/kg y comprende al menos un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
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