POLIPÉPTIDOS CON ACTIVIDAD ENDOGLUCANASA Y POLINUCLEÓTIDOS CODIFICANDO LOS POLIPÉPTIDOS.

Polipéptidos con actividad endoglucanasa y polinucleótidos codificando los polipéptidos. Referencia a un listado de secuencias [0001] Esta solicitud contiene un listado de secuencias en soporte de lectura informática. Este soporte de lectura informática está incorporado aquí por referencia. Referencia a un depósito de material biológico [0002] Esta solicitud contiene una referencia a depósitos de material biológico que han sido producidos en el Northern Regional Research Center (NRRL) conforme al Tratado de Budapest y se le asignó el número de registro NRRL B- 30902. Antecedentes de la invención Campo de la invención [0003] La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad endoglucanasa y a polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huéspedes comprendiendo tanto los polinucleótidos como los métodos para producir y usar los polipéptidos. Descripción de la técnica relacionada [0004] La celulosa es un polímero de la glucosa de azúcar simple unido de manera covalente por enlaces beta-1,4. Muchos microorganismos producen enzimas que hidrolizan betaglucanos. Estas enzimas incluyen endoglucanasas, celobiohidrolasas, y beta-glucosidasas. Las endoglucanasas digieren el polímero de celulosa en lugares aleatorios, abriéndolo para ser atacado por celobiohidrolasas. Las celobiohidrolasas liberan secuencialmente moléculas de celobiosa de las extremidades del polímero de celulosa. La celobiohidrolasa I es una actividad 1,4-beta-D-glucano celobiohidrolasa (E.C. 3,2,1,91) que cataliza la hidrólisis de los enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en celulosa, celotetrosa, o cualquier glucosa beta-1,4- enlazada que contenga polímero, liberando celobiosa de las extremidades reductoras de la cadena. La celobiohidrolasa II es una actividad 1,4-D-glucana celobiohidrolasa (E.C. 3,2,1,91) que cataliza la hidrólisis de los enlaces 1,4-beta-D-glucosidicos en celulosa, celotetrosa, o cualquier glucosa beta 1,4-enlazada que contenga polímero, liberando celobiosa de las extremidades no reductoras de la cadena. La celobiosa es un dímero hidrosoluble beta-1,4-enlazado de glucosa. Las beta-glucosidasas hidrolizan la celobiosa a glucosa. [0005] La conversión de materias primas celulósicas en etanol tiene las ventajas de la disponibilidad inmediata de cantidades grandes de materia prima, la conveniencia de evitar el quemado o vertido de los materiales, y la limpieza del combustible de etanol. La madera, residuos agrícolas, brotes herbáceos, y desperdicios sólidos municipales han sido considerados como materias primas para la producción de etanol. Estos materiales principalmente consisten en celulosa, hemicelulosa y lignina. Una vez que la celulosa se convierte en glucosa, la glucosa es fácilmente fermentada por levadura en etanol. [0006] Roy et al., 1990, Journal of General Microbiology 136: 1967-1972, da a conocer la purificación y propiedades de una endoglucanasa extracelular de Myceliophthora thermophila ATCC 48104. Chernoglazov et al., 1988, Biokhimiya 53: 475-482, da a conocer el aislamiento, purificación, y especificación de sustrato de una endoglucanasa de Myceliophthora thermophila. Kliosov et al., 1988, Cartas de Biotecnología 10: 351-354, da a conocer una endoglucanasa termoestable de Myceliophthora thermophila. Guzhova y Loginova, 1987, Prikladnaia Biokhimiya yo Mikrobiologiya 23: 820-825, da a conocer enzimas celulolíticas de Myceliophthora thermophila. Rabinovich et al., 1986, Bioorganicheskaya Khimiya 12: 1549-1560, da a conocer la purificación y caracterización de una endoglucanasa de Myceliophthora thermophila. Svistova et al., 1986, Mikrobiologiya 55: 49-54, da a conocer la regulación de la biosíntesis de celulosa en Myceliophthora thermophila. Bhat y Maheshwari, 1987, Applied and Environmental Microbiology 53: 2175-2182, da a conocer la actividad de componentes del sistema de celulosa extracelular de Myceliophthora thermophila. Kliosov et al., 1987, Prikladnaya Biokhimiya I Mikrobiologiya 23: 44-50, da a conocer una endoglucanasa termoestable de Myceliophthora termophila. Jorgensen et al., 2003, Enzyme and Microbial Technology 32: 851-861, y Tigesen et al., 2003, Enzyme and Microbial Technology 32: 606-615, dan a conocer enzimas degradantes de celulosa de Penicillium brasilianum IBT 20888. WO2005/659084 describe una endoglucanasa Humicula insolaens con un grado de identidad del 70,9% con la endoglucanasa de la invención, y WO2003/062409 describe una endoglucanasa Cel5A de Thermoascus aurianticus con un grado de identidad del 63% con la endoglucanasa de la invención. [0007] Sería una ventaja para la técnica el identificar endoglucanasas nuevas con propiedades mejoradas, tales como un índice de hidrólisis mejorado, una mejor termoestabilidad, una adsorción reducida a lignina, y la capacidad de hidrolizar componentes no celulósicos de biomasa, tales como la hemicelulosa, además de hidrolizar celulosa. Las endoglucanasas con un amplio intervalo de actividades laterales en hemicelulosa pueden ser especialmente beneficiosas para mejorar el rendimiento de la hidrólisis general de complejos substratos de biomasa ricos en 2   hemicelulosa. [0008] Es un objetivo de esta invención el proporcionar polipéptidos mejorados con actividad de endoglucanasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos. Resumen de la invención [0009] La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad endoglucanasa seleccionados del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de grado de identidad con el polipéptido maduro de la SEC ID nº: 4; (b) un polipéptido que es codificado por un polinucleótido que hibridiza bajo al menos condiciones de astringencia altas con (i) la secuencia codificante de polipéptido maduro de la SEC ID nº: 3, (ii) la secuencia de ADNc contenida en la secuencia codificante de polipéptido maduro de la SEC ID nº: 3 o (iii) una cadena complementaria en toda su longitud de (i) o (ii) donde una alta astringencia se define como hibridación en 5xSSPE y 50% formamida a 42°C y tres lavados de 15 min usando 2x SSC, 0,2% de SDS al menos a 65°C; y (c) un polipéptido que se codifica por un polinucleótido con al menos un 85% de identidad con la secuencia codificante de polipéptido maduro de la SEC ID nº: 3; y donde la actividad endoglucanasa del polipéptido aislado es de al menos un 70% de la actividad endoglucanasa del polipéptido dado a conocer como SEC ID n°. 4 determinado usando hidrólisis de carboximetilcelulosa y donde 1 unidad es definida como 1,0 micromol de azúcares reductores producidos por minuto a 50°C, pH 4.8. [0010] Esta invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos con actividad endoglucanasa, seleccionados del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un grado de identidad de un 85% con el polipéptido maduro de la SEC ID nº: 4; (b) un polinucleótido que hibridiza bajo al menos condiciones de alta astringencia con (i) la secuencia codificante de polipéptido maduro de la SEC ID nº: 3, (ii) la secuencia de ADNc contenida en la secuencia codificante de polipéptido maduro de la SEC ID nº: 3 o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii); (c) un polinucleótido con al menos un grado de identidad del 85% con la secuencia codificante de polipéptido maduro de la SEC ID nº: 3 [0011] En un aspecto preferido, el polipéptido maduro consiste en los aminoácidos de 17 a 389 de la SEC ID nº: 4. En otro aspecto preferido, la secuencia codificante de polipéptido maduro consiste en los nucleótidos 67 a 1185 de la SEC ID nº: 3. [0012] La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células huéspedes recombinantes que comprenden los polinucleótidos, y a métodos de producción de un polipéptido con actividad endoglucanasa. [0013] La presente invención también se refiere a métodos de uso de los polipéptidos con actividad endoglucanasa en la conversión de celulosa a glucosa y sustancias varias. [0014] La presente invención también se refiere a plantas que comprenden un polinucleótido aislado codificando tal polipéptido con actividad endoglucanasa. [0015] La presente invención también se refiere a métodos para producir tal polipéptido con actividad de endoglucanasa, que comprende: (a) cultivar una planta transgénica o una célula vegetal que comprenda un polinucleótido codificando tal polipéptido con actividad endoglucanasa bajo las condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido. Breve descripción de las figuras [0016] La Figura 1 muestra un mapa de restricción de pCIC161. La Figura 2 muestra... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido aislado con actividad endoglucanasa, seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un grado de identidad del 85% con el polipéptido maduro de la SEC ID nº: 4; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibridiza bajo al menos condiciones de astringencia altas con (i) la secuencia codificante de polipéptido maduro de la SEC ID nº: 3, (ii) la secuencia de ADNc contenida en la secuencia codificante de polipéptido maduro de la SEC ID nº: 3, o (iii) una cadena complementaria de longitud completa de (i) o (ii), donde una astringencia alta se define como hibridación en 5xSSPE y formamida al 50% a 42°C y lavado de 15 min tres veces usando 2x SSC, SDS al 0,2% al menos a 65°C; y (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un grado de identidad del 85% con la secuencia codificante de polipéptido maduro de la SEC ID NO:3; y donde la actividad endoglucanasa del polipéptido aislado es al menos un 70% de la actividad endoglucanasa del polipéptido descrito como SEC ID n°. 4 determinado usando hidrólisis de carboximetilcelulosa y donde 1 unidad se define como 1.0 micro mol de azúcares reductores producidos por minuto a 50°C, pH 4.8. 2. Polipéptido según la reivindicación 1, que es codificado por un polinucleótido con preferiblemente al menos una identidad del 90%, y de la forma más preferible al menos una identidad del 95% con la secuencia codificante de polipéptido maduro de la SEC ID nº: 3. 3. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que es codificado por el polinucleótido contenido en el plásmido pCIC161 contenido en E. coli NRRL B-30902. 4. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, donde el polipéptido maduro es los aminoácidos 17 a 389 de la SEC ID nº: 4. 5. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, teniendo además actividad enzimática hacia uno o más sustratos seleccionados del grupo que consiste en xilano, xiloglucano, arabinoxilano. 1,4-beta-D-manano, y galactomanano. 6. Polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5. 7. Constructo de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido según la reivindicación 6 operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión. 8. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 7. 9. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 7. 10. Método para la producción del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5 que comprende: (a) el cultivo de una célula huésped que comprende un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido. 11. Método para la producción del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, que comprende: (a) el cultivo de una planta transgénica o de una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido con actividad endoglucanasa según las reivindicaciones 1-5, bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) la recuperación el polipéptido. 12. Planta transgénica, parte de planta o célula vegetal, que comprende un constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 7. 13. Método de degradación o conversión de un material celulósico, que comprende: el tratamiento del material celulósico con una composición que comprende una cantidad eficaz del polipéptido aislado con actividad endoglucanasa de cualquiera según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5. 14. Método según la reivindicación 13, donde la composición además comprende una cantidad eficaz de una endo-1,4beta-glucanasa, exo-1,4-beta-D-glucanasa, y/o beta-D-glucosidasa. 15. Método según la reivindicación 13 ó 14, donde la composición además comprende una cantidad eficaz de una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una hemicelulasa, esterasa, proteasa, lacasa y peroxidasa. 59   16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 13-15, donde el método es un proceso de pretratamiento; un paso en un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF); o un paso de un proceso de hidrólisis y fermentación híbridas (HHF). 17. Método para producir una sustancia, que comprende: (a) la sacarificación de un material celulósico con una composición que comprende una cantidad eficaz del polipéptido aislado con actividad endoglucanasa según cualquiera de las reivindicaciones de 1-5, (b) la fermentación del material celulósico sacarificado del paso (a) con uno o más microorganismos fermentativos; y (c) la recuperación de la sustancia a partir de la fermentación. 18. Método según la reivindicación 17, donde la composición además comprende una cantidad eficaz de endo-1,4beta-glucanasa, exo-1,4-beta-D-glucanasa, y/o beta-D-glucosidasa. 19. Método según la reivindicación 17 ó 18, donde la composición además comprende una cantidad eficaz de una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una hemicelulasa, esterasa, proteasa, lacasa y peroxidasa. 20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17-19, donde los pasos (a) y (b) se realizan simultáneamente en una sacarificación y fermentación simultáneas. 21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17-20, donde la sustancia es un alcohol, ácido orgánico, cetona, aminoácido o gas.   61   62   63   64     66   67   68   69     71   72   73   74     76   77   78   79