Método para identificar un derivado de cumarina que ejerce un efecto sobre la actividad de un polipéptido de VKORC1 (subunidad 1 del complejo vitamina K-epóxido reductasa) que comprende una secuencia polipeptídica seleccionada de entre el grupo consistente en:

a)una secuencia polipeptídica seleccionada de entre el grupo consistente en una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO:1, 12 y 17;

b)una secuencia polipeptídica de un alelo de la secuencia polipeptídica definida en (a);

c) una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia polipeptídica definida en (a) o (b), donde la secuencia polipeptídica tiene la actividad de VKORC1; y

d)una secuencia polipeptídica de un fragmento de la secuencia polipeptídica definida en (a), (b) o (c) que tiene la actividad de VKORC1,

que incluye las etapas de:

I.proporcionar una célula huésped donde se introducido el ácido nucleico de VKORC1 o un vector que contiene el ácido nucleico de VKORC1;

II.expresar el polipéptido de VKORC1 en la célula huésped;

III.administrar un derivado de cumarina candidato;

IV.determinar la actividad del polipéptido de VKORC1 (valor de actividad del candidato);

V.comparar el valor de la actividad del candidato con un valor de actividad de control; e

VI.identificar el derivado de cumarina candidato como derivado de la cumarina que ejerce un efecto sobre la actividad del polipéptido de VKORC1, siempre que el valor de actividad del candidato sea significativamente diferente del valor de actividad control

Polipéptido VKORC1 de reciclaje de la vitamina K-epóxido, una diana terapéutica de la cumarina y sus derivados.

Campo de la invención

La invención se refiere a métodos para identificar derivados de la cumarina, y reivindica asimismo polipéptidos de VKORC1 y ácidos nucleicos de VKORC1 que contienen una anomalía de secuencia asociada a una deficiencia asociada a VKORC1 tal como la resistencia a la warfarina, donde los polipéptidos de VKORC1 y los ácidos nucleicos de VKORC1 se pueden utilizar para diagnosticar estas deficiencias. Además, la invención se refiere a métodos para identificar aquellos derivados de cumarina que son útiles en el control contra plagas de roedores.

Antecedentes de la invención

La represión de la coagulación sanguínea prematura es la opción terapéutica seleccionada para el tratamiento agudo y la prevención a largo plazo de eventos trombóticos. De entre los anticoagulantes, las cumarinas se utilizan ampliamente para la prevención de la trombosis, por ejemplo en pacientes inmovilizados después de una cirugía, en pacientes con insuficiencia cardíaca crónica, en pacientes con enfermedad vascular ateroesclerótica, en pacientes con tumores malignos y en mujeres embarazadas. Además, las cumarinas son los anticoagulantes orales más utilizados para el tratamiento y la profilaxis de la trombosis [Suttie, 1987]. Las cumarinas son derivados típicos de 6-hidroxicumarina, por ejemplo 3-(actonilbencil)-4-hidroxicumarina (COUMADIN®).

Las cumarinas tienen como objetivo la cascada de coagulación sanguínea indirectamente mediante la inhibición del ciclo de la vitamina K.

La vitamina K es un cofactor esencial para la activación post-traducción por la gamma-carboxilación de un grupo de proteínas reguladoras, las proteínas Gla. En diversas vías metabólicas, algunas proteínas clave necesitan una carboxilación para funcionar adecuadamente. La cascada de coagulación sanguínea es el ejemplo mejor estudiado. Aquí, los factores procoagulantes II, VII, IX y X, así como los factores anticoagulantes proteína C, proteína S, proteína Z, dependen de la gamma-carboxilación. Esta modificación post-traducción permite la fijación de las proteínas modificadas, en presencia de calcio, a las membranas fosfolipídicas bicapa, lo que representa una etapa esencial en la activación de la coagulación sanguínea [Sperling y col., 1978; Esmon y col., 1975]. Otras proteínas que requieren de la gamma-carboxilación son la proteína de matriz gla y la osteocalcina, ambas reguladoras del metabolismo óseo [Price, 1988] y "el gen específico de la inhibición del crecimiento", una proteína señal de transducción del ciclo celular [Manfioletti y col., 1993; Stitt y col., 1995].

Durante la gamma-carboxilación se introduce un grupo carboxilo en los residuos glutamato de las proteínas diana mediante la enzima gamma-glutamil carboxilasa (GGCX) en los microsomas del hígado [Furie & Furie, 1988; Suttie, 1987]. La reacción requiere como cofactor cantidades estequiométricas de vitamina K1-hidroquinona reducida (vitamina K1H2), que se oxida a vitamina K-2,3-epóxido [Cain y col., 1997]. La regeneración del cofactor activo es mediada por un complejo multiproteína denominado vitamina K-2,3-epóxido reductasa (VKOR) [Wallin & Martin, 1985]. El mismo complejo es el objetivo de los venenos de tipo cumarina utilizados en el control plaguicida de roedores. Este "ciclo de la vitamina K" se ha caracterizado bioquímicamente de forma detallada, pero los componentes moleculares no han sido purificados todavía hasta homogeneidad [Guenthner y col., 1981]. Además, la naturaleza molecular de la actividad de la cumarina y las moléculas que interactúan con las cumarinas siguen siendo imprecisas.

En general se aprecia en la técnica que, a pesar de su gran eficacia, existe diversas limitaciones al uso de las cumarinas. En primer lugar, algunos seres humanos son insensibles al tratamiento con cumarina. El término resistencia a la warfarina (WR) se utiliza para individuos que mantienen actividades normales del factor de coagulación a pesar de la anticoagulación oral con cumarinas (Acceso OMIM Nº 122700). Se ha observado una transmisión autosómica dominante en varios linajes [O'Reilly y col., 1964; O'Reilly, 1970]. La deficiencia combinada de todos los factores de coagulación dependientes de la vitamina K (VKCFD) es un trastorno de sangrado muy raro en humanos con herencia autosómica recesiva, 14 casos descritos hasta la fecha [McMillan & Roberts, 1966; Fischer, 1966; Johnson y col., 1980; Goldsmith y col., 1982; Vicente y col., 1984; Ekelund y col., 1986; Pauli y col., 1987; Leonard, 1988; Pechlaner y col., 1992; Boneh & Bar-Ziv, 1996; Brenner y col., 1998; Spronk y col., 2000; Oldenburg y col, 2000]. Los síntomas clínicos de la enfermedad incluyen episodios de hemorragias intracerebrales perinatales, a veces con resultado fatal. Habitualmente, la tendencia al sangrado se invierte por completo mediante la administración oral de vitamina K. Los síntomas adicionales en recién nacidos se asemejan a la embriopatía por warfarina con hipoplasia falangiana basal y distal y calcificación prematura de la epífisis [Pauli y col., 1987]. La enfermedad puede resultar de una resorción/transporte defectuoso de la vitamina K al hígado [Prentice, 1985] o de mutaciones en uno de los genes implicados en la gamma-carboxilación. En el subtipo 1 (VKCFD1, OMIM # 277450), las mutaciones en el gen GGCX sobre el cromosoma 2p12 resultan en una carboxilación insuficiente de los factores de coagulación [Brenner y col., 1998; Spronk y col., 2000]. Se ha descrito una conexión de dos familias con la deficiencia múltiple familiar del factor de coagulación (FMFD, ahora renombrado: VKCFD2, OMIM # 607473) a un intervalo de 20 Mb de la región pericéntrica del cromosoma 16p12-q21 [Fregin y col., 2002]. Los pacientes con VKCFD2 mostraron niveles de suero con un notable aumento de vitamina K-epóxido, sugiriendo así un defecto en una de las subunidades del complejo VKOR. En su conjunto, es evidente que existen pacientes que presentan resistencia a la warfarina. Como consecuencia, existe la necesidad de identificar nuevos derivados de cumarinas que sean anticoagulantes eficaces para tratar a estos pacientes, así como métodos para identificar estos derivados de la cumarina.

El uso de cumarinas se asocia con un riesgo de sangrado espontáneo, con un índice de mortalidad significativo. Además, la predicción de la dosis exacta de mantenimiento de la cumarina es difícil. En ausencia de la molécula diana sobre la que la cumarina ejerce un efecto, el régimen de tratamiento debe establecerse en base a cada paciente. Mientras el régimen óptimo no se ha establecido todavía, el paciente tiene un mayor riesgo de trombogénesis o de sangrado. Por tanto, es necesario un método para determinar el régimen óptimo de tratamiento lo más rápido y seguro posible. Además, el establecimiento de un régimen de tratamiento óptimo se complica por el hecho de que existe un retraso considerable entre la administración de las cumarinas y el desencadenamiento de su actividad anticoagulante. Dada la acción retardada de la cumarina y considerando el hecho de que la cumarina tiende a acumularse con el tiempo, existe la necesidad de derivados de cumarina que permitan la coagulación sanguínea de forma más rápida que las cumarinas conocidas en la técnica. De la misma manera, existe también la necesidad de cumarinas que se metabolicen más rápidamente, de forma que se pueda impedir o mejorar la acumulación de cumarina y, consecuentemente, reducir o suprimir el riesgo de sobredosis.

Se entenderá que cuando el tratamiento con cumarina se inicia durante un estado trombótico, los niveles de proteína C y S disminuyen, creando así temporalmente un potencial trombogénico que normalmente es compensado superponiendo la administración de heparina y cumarina durante varios días. De nuevo, se necesita identificar la diana molecular de acción de la cumarina con el fin de poder buscar nuevos derivados de cumarina que no tengan estas limitaciones o al menos las tengan en menor medida.

A menudo, la terapia con cumarina provoca necrosis de la piel en el paciente y, cuando se aplica durante el embarazo, puede causar embriopatía, creando la necesidad de nuevos derivados de cumarina que no provoquen estos efectos.

Existen diversas interacciones entre los medicamentos y las cumarinas. Algunos de estos medicamentos, como el Fenobarbital, inducen niveles plasmáticos más bajos de las cumarinas debido a la mayor metabolización de la cumarina, que se piensa se debe a las oxidasas de función mixta, como las oxidasas de función mixta citocromo...

1. Método para identificar un derivado de cumarina que ejerce un efecto sobre la actividad de un polipéptido de VKORC1 (subunidad 1 del complejo vitamina K-epóxido reductasa) que comprende una secuencia polipeptídica seleccionada de entre el grupo consistente en:

que incluye las etapas de:

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el valor de actividad de control se determina por medio de un método que comprende las etapas de:

3. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la actividad determinada del polipéptido de VKORC1 es la conversión dependiente de ditiotreitol de vitamina K-2,3-epóxido en vitamina K-quinona y caracterizado porque el valor de actividad significativamente diferente es un valor de actividad del candidato que es significativamente más alto que el valor de actividad de control.

4. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque se introduce al menos un compuesto adicional en la célula huésped, compuesto que se selecciona de entre el grupo consistente en vitamina K, citocromo B5, y un ácido nucleico que codifica para la gamma-glutamil-carboxilasa, para la epoxidehidrolasa microsomal, para la calumenina o para la glutatión-S-transferasa.

5. Método de determinación de la secuencia polipeptídica de VKORC1 que transfiere un efecto de cumarina ejercido sobre la actividad de VKORC1, el cual comprende las etapas de:

donde una desviación significativa del valor de actividad de la anomalía de secuencia con respecto al valor de actividad de la secuencia de control indica que la anomalía de secuencia del polipéptido de VKORC1 transmite el efecto de la cumarina ejercido sobre el polipéptido de VKORC1.

6. Método según la reivindicación 5, caracterizado porque se determina el valor de actividad de la secuencia de control por medio de un método que comprende las etapas de:

7. Método de determinación según la reivindicación 5, caracterizado porque la actividad determinada es la conversión dependiente de ditiotreitol de vitamina K-2,3-epóxido en vitamina K-quinona y caracterizado porque el valor significativamente diferente es un valor de actividad de la anomalía de secuencia que es significativamente más alto que el valor de la actividad de la secuencia de control.

8. Método según la reivindicación 5, caracterizado porque se introduce al menos un compuesto adicional en la célula, compuesto que se selecciona de entre el grupo consistente en la vitamina K, citocromo B5, y un ácido nucleico que codifica para la gamma-glutamil-carboxilasa, para la epoxidehidrolasa microsomal, para la calumenina, o para la glutatión-S-transferasa.

9. Polipéptido de VKORC1, caracterizado porque el polipéptido de VKORC1 contiene al menos una anomalía de secuencia que ejerce un efecto sobre la actividad del polipéptido de VKORC1 y caracterizado porque el polipéptido de VKORC1 es el polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO:1 ó 12, y la anomalía de secuencia se selecciona de entre el grupo consistente en V29L, V45A, R58G, R98W, L128R e Y139C.

10. Método para diagnosticar en un paciente una resistencia a la warfarina o una deficiencia múltiple del factor de coagulación de tipo 2 (VKCFD2), el cual comprende las etapas de:

donde la anomalía determinada de la secuencia indica que el paciente sufre de una deficiencia asociada con VKORC1, preferentemente resistencia a la warfarina.

11. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque el ADN amplificado codifica al menos una secuencia parcial del polipéptido de VKORC1 de acuerdo con la SEQ ID NO:1 y caracterizado porque la anomalía de secuencia se selecciona de entre el grupo consistente en V29L, V45A, R58G, R98W, L128R e Y139C.

12. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque se analiza el ADN amplificado por medio de una técnica seleccionada de entre el grupo consistente en análisis basado en PCR, análisis de digestión de restricción y análisis de secuenciación de ADN.

13. Método para diagnosticar en un paciente la resistencia a warfarina o la deficiencia múltiple del factor de coagulación de tipo 2 (VKCFD2), que comprende las etapas de:

donde la anomalía de secuencia determinada indica que el paciente padece una deficiencia asociada con VKORC1.

14. Método según la reivindicación 13, caracterizado porque se analiza la muestra por medio de una técnica seleccionada de entre el grupo consistente en detección inmunohistoquímica, inmunoblotting, preferentemente Western blotting, y ELISA.

15. Método de identificación de un derivado de cumarina que ejerce un efecto inhibidor sobre la actividad de un polipéptido de VKORC1 con al menos una anomalía de secuencia, el cual comprende las etapas de:

16. Método de identificación de un derivado de cumarina que es toxicológicamente eficaz contra roedores resistentes a la warfarina, el cual comprende las etapas de:

donde el polipéptido de VKORC1 contiene al menos una anomalía de secuencia que provoca la resistencia a la warfarina, preferentemente un polipéptido codificado por la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO:14.

17. Método según la reivindicación 16, caracterizado porque el polipéptido de VKORC1 es el polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO:12 y la anomalía de secuencia se selecciona de entre el grupo consistente en V29L (85 G>T), V45A (134 T>C), R58G (172 A>G), R98W (292 C>T), y L128R (383 T>G) e Y139C (416 A>G).

18. Utilización de los cebadores para PCR de acuerdo con las SEQ ID NO:88 a 91 para determinar si una rata tiene o no un genotipo de resistencia a la warfarina en una muestra obtenida de una rata.