Polinucleótidos para su utilización como etiquetas y complementos de etiqueta, fabricación y utilización de los mismos.

Composición que comprende una pluralidad de complementos de etiqueta de oligonucleótido que presentan hibridación cruzada mínima,

en la que:

(a) cada oligonucleótido está libre de residuos o bien de citosina o bien de guanina,

(b) no hay dos residuos de citosina o de guanina situados adyacentes entre sí en un oligonucleótido y dos residuos de citosina o de guanina cualesquiera están separados como máximo por 6 residuos distintos de citosina o distintos de guanina, respectivamente,

(c) el número de residuos de citosina o de guanina en cada oligonucleótido no supera L/4 en el que L es el número de bases en el oligonucleótido,

(d) la longitud de cada oligonucleótido se diferencia en no más de cinco bases de la longitud media de todos los oligonucleótidos en la composición,

(e) cada oligonucleótido no contiene 4 o más nucleótidos idénticos contiguos,

(f) el número de residuos de guanina o de citosina en cada oligonucleótido no varía del número medio de residuos de guanina o de citosina en todos los demás oligonucleótidos de la composición en más de uno,

(g) cada complemento de etiqueta contiene un residuo de guanina o un residuo de citosina respectivamente, dentro de siete residuos de un extremo del oligonucleótido,

(h) cuando cada complemento de etiqueta de oligonucleótido se expone a condiciones de hibridación que comprenden NaCl 0,2 M, Tris 0,1 M, Triton X-100 al 0,08%, pH 8,0 a 37ºC, el grado máximo de hibridación entre el complemento de etiqueta y una etiqueta que no es totalmente complementaria al complemento de etiqueta no supera el 30% del grado de hibridación entre el complemento de etiqueta y su etiqueta totalmente complementaria; y

(i) en la que cada oligonucleótido presenta entre 18 y 30 nucleótidos de longitud.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/CA2002/000089.

Solicitante: Luminex Molecular Diagnostics, Inc.

Nacionalidad solicitante: Canadá.

Dirección: 439 University Avenue, Suite 900 Toronto, ON M5G 1Y8 CANADA.

Inventor/es: KOBLER,Daniel, FIELDHOUSE,Daniel.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07H21/04 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
  • C12N15/09 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • C40B20/04 C […] › C40 TECNOLOGIA COMBINATORIA.C40B QUIMICA COMBINATORIA; BIBLIOTECAS, p. ej. QUIMIOTECAS (bibliotecas combinatorias in silico de ácidos nucleicos, proteínas o péptidos G16B 35/00; química combinatoria in silico G16C 20/60). › C40B 20/00 Procedimientos especialmente adaptados para la identificación de miembros de una biblioteca. › Identificación de miembros de una biblioteca por medio de una etiqueta ("tag"), de un marcador ("label") o de otro identificador leíble o detectable, p.ej. procedimientos de decodificación.
  • G01N33/53 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
  • G01N33/566 G01N 33/00 […] › utilizando un soporte específico o proteínas receptoras como reactivos para la formación de uniones por ligando.
  • G06F17/30
  • G06F19/00

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Fragmento de la descripción:

Polinucleótidos para su utilización como etiquetas y complementos de etiqueta, fabricación y utilización de los mismos.

Campo de la invención La presente invención se refiere a familias de etiquetas de oligonucleótido para su utilización, por ejemplo, en la clasificación de moléculas. Los miembros de una familia dada de etiquetas pueden distinguirse entre sí mediante hibridación específica con sus complementos de etiqueta.

Antecedentes de la invención La hibridación específica de oligonucleótidos y sus análogos es un procedimiento fundamental que se emplea en una amplia variedad de aplicaciones de investigación, médicas e industriales, incluyendo la identificación de polinucleótidos relacionados con enfermedades en ensayos de diagnóstico, examen para seleccionar clones de polinucleótidos diana novedosos, identificación de polinucleótidos específicos en transferencias de mezclas de polinucleótidos, bloqueo terapéutico de genes expresados de manera inapropiada y secuenciación de ADN. La hibridación específica de secuencia es crítica en el desarrollo de ensayos de ácidos nucleicos multiplexados de alto rendimiento. A medida que los formatos para estos ensayos se expanden para abarcar cantidades mayores de información de secuencia adquirida mediante proyectos tales como el proyecto del genoma humano, el desafío de la hibridación específica de secuencia con alta fidelidad se vuelve cada vez más difícil de lograr.

En gran parte, el éxito de la hibridación utilizando oligonucleótidos depende de minimizar el número de falsos positivos y falsos negativos. Tales problemas han hecho que sea muy difícil la utilización simultánea de múltiples sondas de hibridación en un único experimento, es decir el multiplexado, particularmente en el análisis de múltiples secuencias génicas en un microalineamiento génico. Por ejemplo, en determinados ensayos de unión, se unen varias moléculas de ácido nucleico a un chip con el deseo de que una secuencia "diana" dada se una selectivamente a su complemento unido al chip. Se han desarrollado enfoques que implican la utilización de etiquetas de oligonucleótido unidas a un soporte sólido que pueden utilizarse para hibridarse específicamente a los complementos de etiqueta que se acoplan a secuencias sonda. Chetverin et al. (documento WO 93/17126) utilizan alineamientos de oligonucleótidos binarios, seccionados, para clasificar y analizar ácidos nucleicos. Estos alineamientos presentan una secuencia de nucleótidos constante unida a una secuencia de nucleótidos variable adyacente, ambas unidas a un soporte sólido mediante un resto de unión covalente. Estos alineamientos binarios presentan ventajas en comparación con alineamientos habituales porque pueden utilizarse para clasificar cadenas según sus secuencias terminales de manera que cada cadena se une a una ubicación fija en un alineamiento. El diseño de las secuencias terminales en este enfoque comprende la utilización de secuencias constantes y variables. Las patentes estadounidenses US nº 6.103.463 y nº 6.322.971 concedidas a Chetverin et al. el 15 de agosto de 2000 y el 27 de noviembre de 2001, respectivamente.

Este concepto de utilizar etiquetas moleculares para clasificar una mezcla de moléculas es análogo a etiquetas moleculares desarrolladas para genética bacteriana y de levaduras (Hensel et al., Science; 269, 400-403: 1995 y Schoemaker et al., Nature Genetics; 14, 450-456: 1996) . En este caso, se utiliza un procedimiento denominado mutagénesis "etiquetada con firma" en el que cada mutante se etiqueta con una secuencia de ADN diferente para recuperar genes mutantes de una mezcla compleja de aproximadamente 10.000 colonias bacterianas. En el enfoque de etiquetado de Barany et al. (documento WO 9731256) , conocido como el "chip postal", una familia de moléculas de ácido nucleico, las "direcciones de código postal", cada una diferente de las otras, se exponen en una rejilla. Se unen moléculas diana a secuencias de oligonucleótido complementarias a las "direcciones de código postal", denominadas "códigos postales", que se utilizan para hibridarse específicamente a las locaciones de dirección en la rejilla. Aunque la selección de estas familias de secuencias de polinucleótido utilizadas como direcciones es crítica para un correcto rendimiento del ensayo, no se ha descrito el rendimiento.

Trabajar en un entorno de hibridación altamente paralela que requiere hibridación específica impone muchos criterios de selección rigurosa para el diseño de familias de oligonucleótidos que van a utilizarse. El éxito de estos enfoques depende de la hibridación específica de una sonda y su complemento. Surgen problemas ya que la familia de moléculas de ácido nucleico se hibrida de manera cruzada o se hibrida incorrectamente con las secuencias diana. Aunque es común obtener una hibridación incorrecta que da como resultado falsos positivos o una incapacidad de formar híbridos que da como resultado falsos negativos, la frecuencia de tales resultados debe minimizarse. Para lograr este objetivo deben considerarse determinadas propiedades termodinámicas de formación de híbridos de ácido nucleico. La temperatura a la que los oligonucleótidos forman dúplex con sus secuencias complementarias conocida como la Tm (la temperatura a la que el 50% del dúplex de ácido nucleico está disociado) varía según varias propiedades dependientes de la secuencia incluyendo las energías de formación de puentes de hidrógeno de los pares convencionales A-T y G-C (reflejada en GC o composición de bases) , energía libre de apilamiento y, en menor medida, las interacciones entre vecinos más próximos. Estas energías varían ampliamente entre oligonucleótidos que se utilizan normalmente en ensayos de hibridación. Por ejemplo, la hibridación de dos secuencias de sonda compuestas por 24 nucleótidos, una con un contenido en GC del 40% y la otra con un

contenido de GC del 60%, con su diana complementaria en condiciones convencionales puede presentar teóricamente una diferencia de 10ºC en la temperatura de fusión (Mueller et al., Current Protocols in Mol. Biol.; 15, 5:1993) . Se producen problemas en la hibridación cuando se permite que se formen los híbridos en condiciones de hibridación que incluyen una única temperatura de hibridación que no es óptima para una hibridación correcta de todas las secuencias de oligonucleótido de un conjunto. Puede producirse hibridación de apareamiento erróneo de sondas no complementarias formando dúplex con una estabilidad de apareamiento erróneo medible (Santalucia et al., Biochemistr y ; 38: 3468-77, 1999) . Puede producirse apareamiento erróneo de dúplex en un conjunto particular de oligonucleótidos en condiciones de hibridación en las que el apareamiento erróneo da como resultado una disminución de la estabilidad del dúplex que da como resultado una Tf superior al dúplex correcto menos estable de ese conjunto particular. Por ejemplo, si se lleva a cabo la hibridación en condiciones que favorecen la secuencia de dúplex de apareamiento perfecto rica en AT, existe la posibilidad de hibridación de una secuencia de dúplex rica en GC que contiene una base con apareamiento erróneo que presenta una temperatura de fusión que todavía es superior al dúplex rico en AT formado correctamente. Por tanto, el diseño de familias de secuencias de oligonucleótido que pueden utilizarse en reacciones de hibridación multiplexadas debe incluir la consideración de las propiedades termodinámicas de los oligonucleótidos y la formación de dúplex que reducirán o eliminarán el comportamiento de hibridación cruzada dentro del conjunto de oligonucleótidos diseñados.

Se ha intentado el desarrollo de tales familias de etiquetas a lo largo de los años con diversos grados de éxito. Hay varios enfoques diferentes para seleccionar secuencias para su utilización en ensayos de hibridación multiplexados. La selección de secuencias que pueden utilizarse como códigos postales o etiquetas en un alineamiento direccionable se ha descrito en la bibliografía de patentes en un enfoque adoptado por Brenner y colaboradores. La patente US nº 5.654.413 describe una población de etiquetas de oligonucleótido (y complementos de etiqueta correspondientes) en la que cada etiqueta de oligonucleótido incluye una pluralidad de subunidades, consistiendo cada subunidad en un oligonucleótido que presenta una longitud de desde tres hasta seis nucleótidos y seleccionándose cada subunidad de un conjunto que presenta hibridación cruzada mínima, en el que una subunidad del conjunto presentará al menos dos apareamientos erróneos con cualquier otra secuencia del conjunto. La tabla II de la memoria descriptiva... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Composición que comprende una pluralidad de complementos de etiqueta de oligonucleótido que presentan hibridación cruzada mínima, en la que:

(a) cada oligonucleótido está libre de residuos o bien de citosina o bien de guanina,

(b) no hay dos residuos de citosina o de guanina situados adyacentes entre sí en un oligonucleótido y dos residuos de citosina o de guanina cualesquiera están separados como máximo por 6 residuos distintos de citosina o distintos de guanina, respectivamente,

(c) el número de residuos de citosina o de guanina en cada oligonucleótido no supera L/4 en el que L es el número de bases en el oligonucleótido,

(d) la longitud de cada oligonucleótido se diferencia en no más de cinco bases de la longitud media de todos los oligonucleótidos en la composición,

(e) cada oligonucleótido no contiene 4 o más nucleótidos idénticos contiguos,

(f) el número de residuos de guanina o de citosina en cada oligonucleótido no varía del número medio de residuos de guanina o de citosina en todos los demás oligonucleótidos de la composición en más de uno,

(g) cada complemento de etiqueta contiene un residuo de guanina o un residuo de citosina respectivamente, dentro de siete residuos de un extremo del oligonucleótido,

(h) cuando cada complemento de etiqueta de oligonucleótido se expone a condiciones de hibridación que comprenden NaCl 0, 2 M, Tris 0, 1 M, Triton X-100 al 0, 08%, pH 8, 0 a 37ºC, el grado máximo de hibridación entre el complemento de etiqueta y una etiqueta que no es totalmente complementaria al complemento de etiqueta no supera el 30% del grado de hibridación entre el complemento de etiqueta y su etiqueta totalmente complementaria; y

(i) en la que cada oligonucleótido presenta entre 18 y 30 nucleótidos de longitud.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que cada oligonucleótido está libre de residuos de citosina.

3. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que cuando cada complemento de etiqueta de oligonucleótido se expone a condiciones de hibridación que comprenden NaCl 0, 2 M, Tris 0, 1 M, Triton X-100 al 0, 08%, pH 8, 0 a 37ºC, el grado máximo de hibridación entre el complemento de etiqueta y una etiqueta que no es totalmente complementaria al complemento de etiqueta no supera el 25% del grado de hibridación entre el complemento de etiqueta y su etiqueta totalmente complementaria.

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que cuando cada complemento de etiqueta de oligonucleótido se expone a condiciones de hibridación que comprenden NaCl 0, 2 M, Tris 0, 1 M, Triton X-100 al 0, 08%, pH 8, 0 a 37ºC, el grado máximo de hibridación entre el complemento de etiqueta y una etiqueta que no es totalmente complementaria al complemento de etiqueta no supera el 20% del grado de hibridación entre el complemento de etiqueta y su etiqueta totalmente complementaria.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que cuando cada complemento de etiqueta de oligonucleótido se expone a condiciones de hibridación que comprenden NaCl 0, 2 M, Tris 0, 1 M, Triton X-100 al 0, 08%, pH 8, 0 a 37ºC, el grado máximo de hibridación entre el complemento de etiqueta y una etiqueta que no es totalmente complementaria al complemento de etiqueta no supera el 15% del grado de hibridación entre el complemento de etiqueta y su etiqueta totalmente complementaria.

6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la longitud de cada oligonucleótido en la composición es idéntica.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el número de residuos de guanina o de citosina en cada oligonucleótido es el mismo.

8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que cada oligonucleótido presenta entre 22 y 26 nucleótidos de longitud.

9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que cada oligonucleótido comprende 24 residuos.

10. Composición según la reivindicación 9, en la que cada oligonucleótido contiene 6 residuos de guanina o de

citosina.

11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que los complementos de etiqueta están fijados a un soporte de fase sólida.

12. Composición según la reivindicación 11, en la que el soporte es un sustrato plano que comprende una pluralidad de regiones espacialmente direccionables.

13. Composición según la reivindicación 11, en la que los complementos de etiqueta están covalentemente unidos a micropartículas.

14. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición comprende 150 complementos de etiqueta.

15. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ciento sesenta complementos de etiqueta, o que comprende ciento setenta complementos de etiqueta, o que comprende ciento ochenta complementos de etiqueta, o que comprende ciento noventa complementos de etiqueta, o que comprende doscientos complementos de etiqueta, o que comprende doscientos veinte complementos de etiqueta, o que comprende doscientos cuarenta complementos de etiqueta, o que comprende doscientos sesenta complementos de etiqueta, o que comprende doscientos ochenta complementos de etiqueta, o que comprende trescientos complementos de etiqueta, o que comprende cuatrocientos complementos de etiqueta, o que comprende quinientos complementos de etiqueta, o que comprende seiscientos complementos de etiqueta, o que comprende setecientos complementos de etiqueta, o que comprende ochocientos complementos de etiqueta, o que comprende novecientos complementos de etiqueta, o que comprende mil complementos de etiqueta.

16. Kit para clasificar e identificar polinucleótidos que comprende uno o más soportes de fase sólida que comprenden una pluralidad de regiones espacialmente diferenciadas, presentando cada región una población uniforme de complementos de etiqueta sustancialmente idénticos covalentemente fijados a la misma y seleccionándose cada uno de los complementos de etiqueta a partir de una composición de oligonucleótidos que presentan hibridación cruzada mínima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

17. Kit según la reivindicación 16, en el que uno o más soportes de fase sólida son un sustrato plano y en el que una

o más regiones espacialmente diferenciadas son una pluralidad de regiones espacialmente direccionables.

18. Kit según la reivindicación 16, en el que uno o más soportes de fase sólida son una pluralidad de micropartículas.

19. Kit según la reivindicación 18, en el que dichas micropartículas presentan cada una un diámetro en el intervalo comprendido entre 5 y 40 μm.

20. Kit según la reivindicación 18 o 19, en el que cada micropartícula es espectrofotométricamente única respecto a cada otra micropartícula que presenta un oligonucleótido diferente unido a la misma.

21. Procedimiento de análisis de una muestra biológica que comprende una pluralidad de moléculas de ácido nucleico para determinar la presencia de una mutación o polimorfismo en un locus de cada molécula de ácido nucleico, para cada molécula de ácido nucleico, comprendiendo el procedimiento: (a) hibridar la molécula y un cebador, presentando el cebador una secuencia en 5' que presenta la secuencia de una etiqueta complementaria a la secuencia de un complemento de etiqueta que pertenece a una familia de complementos de etiqueta según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y un extremo 3' que se extiende de manera inmediatamente adyacente al locus; (b) extender enzimáticamente el extremo 3' del cebador en presencia de una pluralidad de derivados de nucleósido trifosfato cada uno de los cuales: (i) puede incorporarse enzimáticamente en el extremo 3' de una cadena de nucleótidos en crecimiento; (ii) provoca la terminación de dicha extensión; y (iii) puede detectarse de manera diferencial, entre sí, en el que uno de dichos derivados es complementario a cada posible nucleótido presente en dicho locus; (c) hibridar específicamente el cebador extendido formado en la etapa (b) con un complemento de etiqueta que presenta la secuencia de complemento de etiqueta de (a) ; y (d) detectar el derivado de nucleótido incorporado en el cebador en la etapa (b) para identificar la base situada en el locus de la molécula de ácido nucleico; en el que cada etiqueta de (a) es única para cada molécula de ácido nucleico y las etapas (a) y (b) se llevan a cabo con dichas moléculas nucleicas una en presencia de otra.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que cada complemento respectivo está unido como una población uniforme de complementos sustancialmente idénticos en una región espacialmente diferenciada en uno o más de dichos soportes de fase sólida.

23. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que cada uno de dichos complementos de etiqueta comprende un marcador, siendo cada uno de dichos marcadores diferente para los complementos respectivos, y la etapa (d) incluye detectar la presencia de los diferentes marcadores para complejos de hibridación respectivos de etiquetas y complementos de etiqueta unidos.

24. Procedimiento de determinación de la presencia de una diana que se sospecha que está contenida en una mezcla, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes: (i) marcar la diana con un primer marcador; (ii) proporcionar un primer resto de detección que puede unirse específicamente a la diana y que incluye una primera etiqueta; (iii) exponer una muestra de la mezcla al resto de detección en condiciones aptas para permitir dicha unión específica del resto y la diana; (iv) proporcionar una familia de complementos de etiqueta según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, conteniendo la familia un primer complemento de etiqueta que presenta una secuencia complementaria a la de la primera etiqueta; (v) exponer la muestra a la familia de complementos de etiqueta en condiciones aptas para permitir la hibridación específica de la primera etiqueta y su complemento de etiqueta; (vi) determinar si dicho primer resto de detección hibridado a un primer dicho complemento de etiqueta está unido a dicha diana marcada para determinar la presencia o ausencia de dicha diana en la mezcla.

25. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicho primer complemento de etiqueta está unido a un soporte sólido en una ubicación específica del soporte y la etapa (vi) incluye detectar la presencia del primer marcador en dicha ubicación específica.

26. Procedimiento según la reivindicación 24 o 25, en el que dicho primer complemento de etiqueta comprende un segundo marcador y la etapa (vi) incluye detectar la presencia del primer y segundo marcadores en un complejo hibridado del resto y el primer complemento de etiqueta.

27. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en el que dicha diana se selecciona de entre el grupo constituido por moléculas orgánicas, antígenos, proteínas, polipéptidos, anticuerpos y ácidos nucleicos.

28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, en el que dicha diana es un antígeno y dicha primera molécula es un anticuerpo específico para dicho antígeno.

29. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, en el que el antígeno es un polipéptido o una proteína y la etapa de marcaje incluye la conjugación de moléculas fluorescentes, digoxigenina, biotinilación y similares.

30. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, en el que dicha diana es un ácido nucleico y la etapa de marcaje incluye la incorporación de moléculas fluorescentes, nucleótido radiomarcado, digoxigenina, biotinilación y similares.

 

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