Polinucleótido apto para un ensayo indicador basado en una sola célula para controlar los patrones de expresión génica con una resolución espacio-temporal elevada.

Polinucleótido bicatenario apto para llevar a cabo el ensayo de expresión de la perfilación génica cuando se integra en la célula que aloja de manera natural y expresa posiblemente el gen o genes de interés para dicha perfilación,

que comprende en su cadena positiva considerada desde su extremo 5' a su extremo 3', (i) un promotor de un gen de interés o varios promotores de varios genes de interés seleccionados de entre varios genes que son (a) endógenos a la célula y están (b) sometidos a perfilación de la expresión génica, en el que dicho promotor es reconocido por el mecanismo de transcripción interna de la célula y, (ii) uno o varios códigos de barras en el que cada código de barras contiene por lo menos una unidad de código de barras que es un montaje de ADN que comprende repeticiones en tándem de un sitio de unión de reconocimiento de baliza o repeticiones en tándem de por lo menos dos sitios de unión de reconocimiento diferentes de baliza, estando compuesto cada sitio de unión por una secuencia de nucleótidos que se hibrida específicamente con la parte de lazo de una baliza molecular en la que la parte de lazo presenta de 10 a 55 nucleótidos y en el que cada uno de dicho(s) código(s) de barras está(n) bajo el control de por lo menos uno de dicho(s) promotor(es) para la transcripción.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E07291093.

Solicitante: INSTITUT PASTEUR.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: 25-28, RUE DU DOCTEUR ROUX 75724 PARIS CEDEX 15 FRANCIA.

Inventor/es: SANSONETTI, PHILIPPE, MHLANGA,MUSA, ENNINGA,JOST, NEHRBASS,ULF.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2391906_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Polinucleótido apto para un ensayo indicador basado en una sola célula para controlar los patrones de expresión génica con una resolución espacio-temporal elevada.

La invención se refiere a un ensayo para controlar los patrones de expresión génica, especialmente en una célula viva, recurriendo a un sistema indicador de la transcripción. El ensayo de la invención proporciona unos medios adecuados para una rápida y alta resolución espacio-temporal de dichos patrones. El ensayo de la invención puede utilizarse además para el seguimiento cuantitativo de la transcripción génica.

La invención proporciona en particular la posibilidad de realizar el ensayo diseñado en células aisladas. Se proporciona también especialmente la posibilidad de realizar el ensayo diseñado en una célula viva.

Así pues, la invención proporciona un ensayo que permite controlar la producción de ARN, en su caso un ARNm específico, en una célula viva.

El campo de aplicaciones de la invención comprende el seguimiento de la expresión génica a fin de determinar o controlar la regulación de la homeostasis celular, la actividad celular o la desregulación de la homeostasis o actividad celular u otros procesos celulares.

La invención permite en particular controlar la expresión génica en las células que se han sometido a prueba de provocación por episodios extracelulares, tales como el estrés causado por agentes patógenos u organismos, fármacos o productos químicos. Las células para su utilización según la invención comprenden cualquier tipo de células procariotas o eucariotas. En un aspecto concreto de la invención, estas células se pueden obtener de un hospedador, especialmente un hospedador mamífero, en particular un paciente afectado con una afección patológica. También comprende la determinación de las interacciones hospedador/patógeno, en la célula viva.

La invención proporciona así unos medios adecuados para un alto rendimiento y un alto contenido de identificación.

Así pues proporciona herramientas para su utilización en estrategias de desarrollo de fármacos, y más en general permite controlar la expresión génica en las células vivas y permite la perfilación de genes con fines de identificación. Las aplicaciones específicas de la invención incluyen el seguimiento de las células de un paciente infectado con organismos o agentes patógenos, tales como bacterias, virus, parásitos. Las células ensayadas como tal puede estar infectadas o no. La invención también proporciona unos medios para el seguimiento de las reacciones inmunitarias en una célula o para el seguimiento del desarrollo o la creación de las células tumorales.

Las células vivas están en constante comunicación con su entorno lo que requiere la adaptación de su fisiología a las circunstancias específicas. Estos episodios de comunicación juegan un papel importante (i) para la interferencia entre células individuales de un organismo (por ejemplo durante el desarrollo) , o (ii) para la respuesta eficaz a la tensión desde el exterior. El estrés puede ser físico (por ejemplo calor) , químico (por ejemplo productos químicos tóxicos) o bioquímico (por ejemplo, bacterias patógenas) .

En general, las células alteran la expresión de genes específicos para ajustarse durante las situaciones descritas anteriormente. En particular, la expresión génica está muy regulada temporalmente lo que permite una respuesta equilibrada celular al estrés. La alteración de este equilibrio conduce a la enfermedad.

En el caso del estrés causado por patógenos, estos factores estresantes han desarrollado estrategias para atacar específicamente y alterar la expresión génica celular del hospedador (Arbibe, L. et al. An injected bacterial effector targets chromatin access for transcription factor NF-kappaB to alter transcription of host genes involved in immune responses. Nat. Immunol. 8, 47-56 (2007) ) . Esto puede conducir a una interferencia con la respuesta inmunitaria del hospedador, y al escape del agente patógeno del seguimiento inmunitario del hospedador (por ejemplo Mycobacterium tuberculosis) (Monack D.M., Mueller A., Falkow S. Persistent bacterial infections: the interface of the pathogen and the host immune system. Nat. Rev. Microbiol. Sep. 2004; 2 (9) :747-65) . Distorsiones similares ocurren durante la desregulación en las enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo artritis o lupus) (Kyttaris V.C., et al.

Immune cells and cytokines in systemic lupus er y thematosus: an update. Curr. Opin. Rheumatol. Sep. 2005; 17 (5) :518-22) .

Por lo tanto, un conocimiento preciso de las respuestas de expresión génica puesta a sitio es fundamental para entender la base molecular de las reacciones celulares al estrés, o las especificidades de las etapas celulares reguladas durante el desarrollo.

La época posgenómica ha proporcionado una gran cantidad de información de varios sistemas genómicos, lo que permite el análisis de la complejidad de los procesos biológicos a gran escala, y con un alto rendimiento (Barabási,

A.L. y Oltvai, Z.N. Network biology: understanding the cell's functional organization. Nat. Rev. Genet. 5, 101-113 (2004) ) . Los ejemplos de estos son el análisis de proteínas por espectrometría de masas y transcripción y perfilación

de la expresión por chips de proteínas y de ADN (Pepperkok, R. y Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nat. Rev. MoI. Cell Biol. 7, 690-696 (2006) ) .

La comprensión de las interacciones entre los componentes de un sistema biológico y la forma en la que dan lugar a la función es un objetivo clave cuando se estudia la biología de sistemas. La mayor parte de nuestra información actual sobre la activación de genes corriente abajo en muchas cascadas de transducción de señales procede de los datos de chips o de ensayos con gen indicador de proteínas (Pepperkok, R. y Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nat. Rev. MoI. Cell Biol. 7, 690-696 (2006) ) . Los métodos con chip pueden proporcionar información de la población o "censo" del comportamiento de millones de células. Sin embargo, cada célula está involucrada de la manera más probable en una fase diferente de la respuesta a la cascada de señalización y lo que se mide es una imagen más global y general. Dentro de este panorama mosaico se encuentra la información sobre cuándo las células específicas se dedican en fases específicas de su respuesta génica. Teóricamente ésta puede estar relacionada temporalmente con cuando se activa la vía y ayuda en la montaje de modelos mecánicos de las modalidades de cómo funcionan dichas cascadas de transducción de señal dinámica. Sin embargo la información temporal precisa de dicha respuesta de la transcripción está enmascarada en el "ruido" o las variaciones estocásticas de los datos del chip.

La exploración de macromoléculas en su entorno natural con alta resolución espacio-temporal ha sido posible mediante la utilización de análisis de detección por la imagen por fluorescencia en las células vivas (Pepperkok, R. y Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nat. Rev. MoI. Cell Biol. 7, 690-696 (2006) , Bastiaens, P.I. y Pepperkok, R. Observing proteins in their natural habitat: the living cell. Trends Biochem. Sci. 25, 631-637 (2000) ; Meyer, T. y Teruel, M.N. Fluorescence imaging of signaling networks. Trends Cell Biol. 13, 101-106 (2003) ; Wouters, F.S., Verveer, P.J. y Bastiaens, P.I. Imaging biochemistr y inside cells. Trends Cell Biol. 11, 203-211 (2001) . En principio, se pueden utilizar para explorar las proteínas en su hábitat natural, interrogando a sus interacciones bioquímicas. Sin embargo, esto no se ha extendido fácilmente a la dinámica de detección por la imagen de la expresión génica, por ejemplo mediante la observación de la transcripción del ARN mensajero. El examen de esta actividad en la célula aislada permitiría la relación temporal entre la activación de una cascada de transducción de la señal (los episodios bioquímicos) y una respuesta de transcripción específica que debe relacionarse con precisión.

Aunque esto se ha intentado con ensayos con genes informadores tales como ensayos con proteína fluorescente o luciferasa, lo que se mide es la lectura de la traducción y no de la transcripción de un solo gen en lo que es lo más probable cientos de genes que participan en una respuesta de la transcripción.... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Polinucleótido bicatenario apto para llevar a cabo el ensayo de expresión de la perfilación génica cuando se integra en la célula que aloja de manera natural y expresa posiblemente el gen o genes de interés para dicha perfilación, que comprende en su cadena positiva considerada desde su extremo 5' a su extremo 3', (i) un promotor de un gen de interés o varios promotores de varios genes de interés seleccionados de entre varios genes que son

(a) endógenos a la célula y están (b) sometidos a perfilación de la expresión génica, en el que dicho promotor es reconocido por el mecanismo de transcripción interna de la célula y, (ii) uno o varios códigos de barras en el que cada código de barras contiene por lo menos una unidad de código de barras que es un montaje de ADN que comprende repeticiones en tándem de un sitio de unión de reconocimiento de baliza o repeticiones en tándem de por lo menos dos sitios de unión de reconocimiento diferentes de baliza, estando compuesto cada sitio de unión por una secuencia de nucleótidos que se hibrida específicamente con la parte de lazo de una baliza molecular en la que la parte de lazo presenta de 10 a 55 nucleótidos y en el que cada uno de dicho (s) código (s) de barras está (n) bajo el control de por lo menos uno de dicho (s) promotor (es) para la transcripción.

2. Polinucleótido según la reivindicación 1, en el que en un código de barras, por lo menos 2 de los sitios de unión de reconocimiento son contiguos y/o por lo menos 2 de las unidades de código de barras son contiguos.

3. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en el que en un código de barras, por lo menos 2 de los sitios de unión de reconocimiento están separados por un separador y/o por lo menos 2 de las unidades de código de barras están separadas por un separador.

4. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el número de sitios de unión de reconocimiento en un código de barras es hasta 500.

5. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que cada unidad de código de barras comprende por lo menos 3 sitios de unión de reconocimiento diferentes y en el que cada código de barras comprende o consiste en 3 unidades de código de barras.

6. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además corriente abajo de un promotor, controlado por dicho promotor, un ADN que codifica una proteína marcadora, en el que dicho ADN de codificación está dispuesto bajo el control de los elementos reguladores de la expresión, inclusive, bajo el control de dicho promotor.

7. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además una secuencia codificadora de un gen de interés, bajo el control de dicho promotor para la transcripción y la expresión.

8. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el promotor de un gen de interés se selecciona de entre el grupo de promotores de genes implicados en la respuesta inmunitaria, especialmente en la respuesta inmunitaria innata, tales como promotores de genes de quimiocina o de citocinas, especialmente promotores de genes de interleucina, o promotores de genes de moléculas de adhesión celular tales como genes ICAM, promotores de gen de interferón, o se selecciona de entre promotores de genes que codifican proteínas asociadas a tumores.

9. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que las secuencias de los sitios de unión de reconocimiento son secuencias no mamíferas, especialmente no humanas.

10. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que un sitio de unión de reconocimiento presenta una de las siguientes secuencias:

5'-TTCTCTTCAAACTTTTCCGCTTTT-3' o, .

5. CGCCAAAACCTATTATCTTAAGTC-3' o.

5. CTCACCTGCTCTTCTCAGACC-3' .

5. GCTATAGCACTAAGGTAAGACCC-3'.

11. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que cada secuencia de repetición en tándem está enmarcada por uno o varios sitios de restricción.

12. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el código de barras contiene una o varias secuencias de nucleótidos o varias repeticiones de las mismas seleccionadas de entre la secuencia de terminación de la transcripción y la secuencia de poli A.

13. Vector que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, clonado en el mismo.

14. Vector según la reivindicación 13, que es un plásmido, un cósmido, un virus o un bac.

15. Célula viva o estirpe celular, excluyendo una célula o estirpe celular embrionaria humana, que comprende, integrada especialmente de manera estable, uno o varios polinucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

16. Célula viva o estirpe celular según la reivindicación 15, que es una célula eucariota, seleccionada especialmente de entre células de mamíferos, especialmente humanos, y se selecciona de entre células diferenciadas, células pluripotentes y células madre, o es una estirpe celular derivada de dichas células, especialmente una estirpe celular de mamífero, en particular una estirpe celular humana.

17. Célula o estirpe celular según la reivindicación 15 o 16, que resulta de la transfección de una célula o estirpe celular con un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

18. Conjunto de células o estirpes celulares excluyendo una célula o estirpe celular embrionaria humana en el que cada una de las células comprende, integrados especialmente de manera estable en las mismas, uno o varios polinucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, presentando cada célula o estirpe celular un contenido en dicho (s) polinucleótido (s) , diferente de las otras células o estirpes celulares.

19. Conjunto de polinucleótidos diferentes según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

20. Kit que comprende (i) un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o un conjunto de polinucleótidos diferentes según la reivindicación 18, y (ii) una célula o una estirpe celular o un conjunto de células o estirpes celulares excluyendo una célula o estirpe celular embrionaria humana, adaptadas para la integración de dicho polinucleótido o conjunto de polinucleótidos, y/o una o varias sondas de detección molecular.

21. Kit que comprende un conjunto de células o estirpes celulares según la reivindicación 18 y reactivos apropiados para mantener las células en condiciones adecuadas para ensayar la actividad de transcripción de los polinucleótidos integrados en las mismas.

22. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 20 o 21, que comprende además una o varias sondas de detección que pueden hibridar con el/los sitio (s) de unión de reconocimiento del (de los) código (s) de barras, resultando dicha (s) sonda (s) de detección adecuadas para la visualización o la medición cuando se hibridan con su secuencia diana.

23. Kit según la reivindicación 22, en el que la (s) sonda (s) de detección es (son) una o varias baliza (s) molecular (es) que pueden hibridar con el/los sitio (s) de unión de reconocimiento de baliza del (de los) código (s) de barras de baliza, presentando dicha (s) baliza (s) molecular (es) una estructura de polinucleótido en tallo-lazo y que es adecuada para la visualización o la medición cuando se hibrida a su secuencia diana, especialmente de manera reversible.

24. Kit según la reivindicación 22 o 23, en el que la visualización de la hibridación de la (s) sonda (s) de detección con su diana se obtiene como resultado de la fluorescencia, que se activa cuando la sonda de detección se une a su secuencia diana.

25. Kit según la reivindicación 23 o 24, en el que la baliza molecular es una estructura de polinucleótido en tallo-lazo en el que la parte de lazo del polinucleótido es la secuencia de la sonda adecuada para hibridarse específicamente con un sitio de unión de la baliza y la parte de tallo se compone de dos brazos formados por secuencias complementarias entre sí, alojando cada una de las secuencias de brazo, unida a su extremo libre que es contrario a la parte de lazo del polinucleótido, uno de un resto fluorescente o de un resto de atenuación no fluorescente en el que dichos restos, cuando están unidos a dichas secuencias de brazo, están suficientemente próximos unos de otros para producir la fluorescencia del resto fluorescente que debe atenuarse por transferencia de energía de resonancia fluorescente, y además dicha parte de lazo del polinucleótido es por lo menos dos veces más larga en los nucleótidos que cada estructura de polinucleótido de brazo.

26. Kit según la reivindicación 25, en el que el resto fluorescente y el resto atenuador no fluorescente están unidos por enlace covalente a las secuencias de brazo en la estructura de polinucleótido en tallo-lazo.

27. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en el que el resto fluorescente (fluoróforo) se selecciona de entre el grupo de puntos cuánticos y derivados, familia Alexafluor de colorantes, FAM, TET o CAL FluorGold 540, HEX o JOE, VICB , CAL Fluor Orange 560A ; Cy3C o NEDB , Quasar 570A , Oyster 556D; TMR o CAL Fluor Red 590A; ROX o LC rojo 610E , CAL Fluor Red 610A , rojo Texas, o rojo LC 610E, CAL Fluor Red 610A; LC Rojo 640E o CAL Fluor Red 635A; Cy5C o LC Rojo 670E, Quasar 670A, Oyster 645D, LC rojo 705E o Cy5.5C o ácido 5- (2'aminoetil) aminonaftalen-1-sulfónico (EDANS) , fluoresceína, antranilamida, cumarina, y quelatos de terbio.

28. Kit según la reivindicación 27, en el que el atenuador se selecciona en el grupo de DDQ-IA (absorción máx. 430 μm) , Dabcyl (absorción max. 475) , EclipseB (absorción max. 530) , Iowa Black FQC (absorción máx. 532) , BHQ

1D (absorción máx. 534) , QSY-7E (absorción máx. 571) , BHQ-2D (absorción máx. 580) , DDQ-IIA (absorción máx. 630) , Iowa Black RQC (absorción máx. 645) , QSY-21E (absorción máx. 660) , BHQ-3D (absorción máx. 670) , oro, metales de tierras raras o ácido 4- (4'-dimetilaminofenilazo) benzoico (DABCYL) , rodamina, pirenobutirato, eosina, nitrotirosina, etidio y tetrametil-rodamina.

29. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28, en el que la parte de lazo de la baliza molecular presenta de 10 a 55 nucleótidos y cada estructura de polinucleótido del brazo presenta de 4 a 16 nucleótidos.

30. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, en el que las balizas moleculares presentan una de las 10 siguientes secuencias de nucleótidos:

5'-GCUGC AAAAGCGGAAAAGUUUGAAGAGAA GCAGC-3' o 5'-CGACC GACUUAAGAUAAUAGGUUUUGGCG GGUCG-3'

31. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30, que comprende además un plásmido con polinucleótido de código de barras clonado corriente abajo del gen o promotor de interés, y/o sondas que pueden reconocer el polinucleótido de código de barras, y/o reactivos tales como péptidos, lípidos, productos químicos que pueden introducir sondas y plásmidos en las estirpes celulares o microinyectarlos dentro de la célula, y/o referencias positivas y negativas para cada etapa en el procedimiento experimental según se necesite.

32. Célula o estirpe celular según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, que comprende además una o varias sondas de detección moleculares como se define en cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30.


 

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