Polímeros recombinantes no estructurados y usos de los mismos.

Proteína de fusión que incorpora:

(I) un polímero recombinante no estructurado (URP) que comprende una secuencia contigua de al menos 40 aminoácidos,

en el que dicho URP se caracteriza porque:

(a) contiene sólo 3, 4, 5, ó 6 tipos diferentes de aminoácidos;

(b) la suma de los residuos de glicina (G), aspartato (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P) constituye más de aproximadamente el 80% de los aminoácidos totales;

(c) al menos el 50% de los aminoácidos no están presentes en la estructura secundaria tal como se ha determinado por el algoritmo de Chou-Fasman; y

(d) tiene una puntuación de epítopo T inferior a -4;

comprendiendo además la proteína de fusión:

(II) una proteína heteróloga,

en la que dicha proteína de fusión muestra una semivida en suero al menos dos veces más larga en comparación con la correspondiente proteína heteróloga que carece de dicho URP,

en la que dicha proteína heteróloga es una proteína farmacéuticamente activa seleccionada del grupo que consiste en citoquinas, factores de crecimiento, hormonas, eritropoyetina, adenosina desiminasa, asparaginasa, arginasa, interferón, hormona de crecimiento, hormona liberadora de hormona de crecimiento, G-CSF, GM-CSM, insulina, hirudina, receptor de TNF, uricasa, rasburicasa, axoquina, ARNasa, ADNasa, fosfatasa, exotoxina de Pseudomonas, ricina, gelonina, desmoteplasa, laronidasa, trombina, enzima de coagulación de la sangre, VEGF, protropina, somatropina, alteplasa, interleucina, factor VII, factor VIII, factor X, factor IX, dornasa, glucocerebrosidasa, folitropina, glucagón, tirotropina, nesiritida, alteplasa, teriparatida, agalsidasa, laronidasa, metioninasa.

Polímeros recombinantes no estructurados y usos de los mismos

REFERENCIA CRUZADA

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se ha documentado bien que las propiedades de proteínas, en particular eliminación del plasma e inmunogenicidad, pueden mejorarse uniendo polímeros hidrófilos a estas proteínas (Kochendoerfer, G. (2003) Expert Opin Biol Ther, 3: 1253-61) , (Greenwald, R. B. y col. (2003) Adv Drug Deliv Rev, 55: 217-50) , (Harris, J. M. y col. (2003) Nat Rev Drug Discov, 2: 214-21) . Ejemplos de proteínas modificadas con polímeros que han sido autorizada por la FDA para el tratamiento de pacientes son Adagen, Oncaspar, PEG-Intron, Pegasys, Somavert y Neulasta. Muchas más proteínas modificadas con polímeros están en ensayos clínicos. Estos polímeros ejercen su efecto aumentando el radio hidrodinámico (también llamado radio de Stoke) de la proteína modificada con respecto a la proteína sin modificar, que reduce la tasa de eliminación por filtración del riñón (Yang, K. y col. (2003) Protein Eng, 16: 761-70) . Además, la unión del polímero puede reducir la interacción de la proteína modificada con otras proteínas, células o superficies. En particular, la unión del polímero puede reducir interacciones entre la proteína modificada y anticuerpos y otros componentes del sistema inmunitario, reduciendo así la formación de una respuesta inmunitaria del huésped a la proteína modificada. Es de particular interés la modificación de proteínas por PEGilación, es decir, uniendo polímeros lineales o ramificados de polietilenglicol. Se mostró inmunogenicidad reducida tras la PEGilación, por ejemplo, para fenilalanina amoniaco liasa (Gamez, A. y col. (2005) Mol Ther, 11: 986-9) , anticuerpos (Deckert, P. M. y col. (2000) Int J Cancer, 87: 382-90.) , estafilocinasa (Collen, D. y col. (2000) Circulation, 102: 1766-72) y hemoglobina (Jin, C. y col. (2004) Protein Pept Lett, 11: 353-60) . Normalmente, tales polímeros se conjugan con la proteína de interés mediante una etapa de modificación química después de que se haya purificado la proteína sin modificar.

Pueden unirse diversos polímeros a proteínas. Son de particular interés polímeros hidrófilos que tienen conformaciones flexibles y se hidratan bien en disoluciones acuosas. Un polímero frecuentemente usado es polietilenglicol (PEG) . Estos polímeros tienden a tener grandes radios hidrodinámicos con respecto a su peso molecular (Kubetzko, S. y col. (2005) Mol Pharmacol, 68: 1439-54) . Los polímeros unidos tienen a tener interacciones limitadas con la proteína a la que se han unido y así la proteína modificada con polímero retiene sus funciones relevantes.

La conjugación química de polímeros con proteínas requiere complejos procedimientos de múltiples etapas. Normalmente, el componente de proteína necesita producirse y purificarse antes de la etapa de conjugación química. La etapa de conjugación puede producir la formación de mezclas de productos que necesitan separarse, conduciendo a una pérdida significativa de producto. Alternativamente, tales mezclas pueden usarse como producto farmacéutico final. Algunos ejemplos son productos de interferón-alfa PEGilados actualmente comercializados que se usan como mezclas (Wang, B. L. y col. (1998) J Submicrosc Cytol Pathol, 30: 503-9; Dhalluin, C. y col. (2005) Bioconjug Chem, 16: 504-17) . Tales mezclas son difíciles de fabricar y caracterizar y contienen isómeros con actividad reducida o no terapéutica.

Se han descrito procedimientos que permiten la adición específica para sitio de polímeros como PEG.

Ejemplos son la PEGilación selectiva en un único sitio de glicosilación de la proteína diana o la PEGilación selectiva de un aminoácido no natural que ha sido manipulado en las proteínas diana. En algunos casos ha sido posible PEGilar selectivamente el extremo N de una proteína, a la vez que se evita la PEGilación de cadenas laterales de lisina en la proteína diana controlando cuidadosamente las condiciones de reacción. Todavía otro enfoque para la PEGilación específica para sitio de proteínas diana es la introducción de residuos de cisteína que permiten la 50 conjugación selectiva. Todos estos procedimientos tienen limitaciones significativas. La PEGilación selectiva del extremo N requiere un cuidado control del procedimiento y las reacciones secundarias son difíciles de eliminar. La introducción de cisteínas para la PEGilación puede interferir con la producción y/o purificación de proteínas. La introducción específica de aminoácidos no naturales requiere organismos huésped específicos para la producción de proteínas. Otra limitación de la PEGilación es que el PEG se fabrica normalmente como una mezcla de polímeros 55 con longitud similar, pero no uniforme. Las mismas limitaciones son inherentes en muchos otros polímeros químicos.

La conjugación química usando polímeros multifuncionales que permitirían la síntesis de productos con módulos de múltiples proteínas es incluso más compleja que la conjugación de polímeros de un dominio de una sola proteína.

Recientemente se ha observado que algunas proteínas de organismos patógenos contienen secuencias de péptidos repetitivas que parece que conducen a una semivida en suero relativamente larga de las proteínas que contienen estas secuencias (Alvarez, P. y col. (2004) J Biol Chem, 279: 3375-81) . Se ha demostrado 5 que secuencias oligoméricas que se basan en tales secuencias repetitivas derivadas de patógeno pueden fusionarse con otras proteínas produciendo elevada semivida en suero. Sin embargo, estos oligómeros derivados de patógeno tienen varias deficiencias. Las secuencias derivadas de patógeno tienden a ser inmunogénicas. Se ha descrito que las secuencias pueden modificarse para reducir su inmunogenicidad. Sin embargo, no se ha informado de intentos para eliminar epítopos de linfocitos T de las secuencias que contribuyen a la formación de reacciones inmunitarias. Además, las secuencias derivadas de patógeno no se han optimizado para aplicaciones farmacológicas que requieren secuencias con buena solubilidad y una afinidad muy baja por otras proteínas diana.

Así, hay una necesidad significativa de composiciones y procedimientos que permitirían que se combinaran módulos de múltiples polímeros y módulos de múltiples proteínas en productos de múltiples dominios definidos.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación proporciona un polímero recombinante no estructurado (URP) que comprende al menos 40 aminoácidos contiguos, en el que dicho URP es sustancialmente incapaz de unirse no específicamente a una proteína del suero, y en el que (a) la suma de los residuos de glicina (G) , aspartato (D) , alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) y prolina (P) contenidos en el URP constituye más de aproximadamente el 80% de los aminoácidos totales del URP; y/o (b) al menos el 50% de los aminoácidos carecen de estructura secundaria como se ha determinado por el algoritmo de Chou-Fasman. En un realización relacionada, la presente divulgación describe un polímero recombinante no estructurado (URP) que comprende al menos 40 aminoácidos contiguos, en el que dicho URP tiene una semivida de degradación en suero in vivo superior a aproximadamente 24 horas, y en el que (a) la suma de los residuos de glicina (G) , aspartato (D) , alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) y prolina (P) contenidos en el URP constituye más de aproximadamente el 80% de los aminoácidos totales del URP; y/o (b) al menos el 50% de los aminoácidos carecen de estructura secundaria como se ha determinado por el algoritmo de 30 Chou-Fasman. El URP de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos no naturales. Si se desea, el URP se selecciona para la incorporación en una proteína heteróloga, y en el que tras la incorporación del URP en una proteína heteróloga, dicha proteína heteróloga presenta una semivida de secreción en suero prolongada y/o mayor solubilidad con respecto a la proteína correspondiente que es deficiente en dicho URP. La semivida puede prolongarse dos veces, tres veces, cinco veces, diez veces o más. En algunos aspectos, la incorporación del URP 35 en una proteína heteróloga produce al menos un aumento de 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o más en el peso molecular aparente de la proteína como se aproxima por cromatografía de exclusión por tamaño. En algunos aspectos, los URP tienen una puntuación de epítopo T inferior a -3, 5 (por ejemplo, -4 o menos, -5 o menos) . En algunos aspectos, los URP pueden contener predominantemente residuos hidrófilos. Si se desea, al menos el 50% de los aminoácidos del URP carecen de estructura secundaria como se ha determinado por el algoritmo de Chou40... [Seguir leyendo]

1. Proteína de fusión que incorpora:

(I) un polímero recombinante no estructurado (URP) que comprende una secuencia contigua de al menos 40 aminoácidos, en el que dicho URP se caracteriza porque:

(a) contiene sólo 3, 4, 5, ó 6 tipos diferentes de aminoácidos;

(b) la suma de los residuos de glicina (G) , aspartato (D) , alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) y prolina (P) constituye más de aproximadamente el 80% de los aminoácidos totales;

(c) al menos el 50% de los aminoácidos no están presentes en la estructura secundaria tal como se ha determinado por el algoritmo de Chou-Fasman; y

(d) tiene una puntuación de epítopo T inferior a -4; comprendiendo además la proteína de fusión:

(II) una proteína heteróloga, en la que dicha proteína de fusión muestra una semivida en suero al menos dos veces más larga en comparación con la correspondiente proteína heteróloga que carece de dicho URP, en la que dicha proteína heteróloga es una proteína farmacéuticamente activa seleccionada del grupo que consiste en citoquinas, factores de crecimiento, hormonas, eritropoyetina, adenosina desiminasa, asparaginasa, arginasa, interferón, hormona de crecimiento, hormona liberadora de hormona de crecimiento, G-CSF, GM-CSM, insulina, hirudina, receptor de TNF, uricasa, rasburicasa, axoquina, ARNasa, ADNasa, fosfatasa, exotoxina de Pseudomonas, ricina, gelonina, desmoteplasa, laronidasa, trombina, enzima de coagulación de la sangre, VEGF, protropina, somatropina, alteplasa, interleucina, factor VII, factor VIII, factor X, factor IX, dornasa, glucocerebrosidasa, folitropina, glucagón, tirotropina, nesiritida, alteplasa, teriparatida, agalsidasa, laronidasa, metioninasa.

2. Proteína, según la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión tiene un incremento de al menos 2 veces en el peso molecular aparente en comparación con la proteína heteróloga que carece de dicho URP, tal como se obtiene por aproximación mediante cromatografía por exclusión de tamaño.

3. Proteína, según la reivindicación 1, en la que la proteína farmacéuticamente activa es una hormona del crecimiento.

4. Proteína, según la reivindicación 1, en la que la proteína farmacéuticamente activa es la insulina.

5. Proteína, según la reivindicación 1, en la que la proteína farmacéuticamente activa es el factor VIII.

6. Proteína, según la reivindicación 1, en la que la proteína farmacéuticamente activa es el factor VII.

7. Proteína, según la reivindicación 1, en la que la proteína farmacéuticamente activa es el factor IX.

8. Proteína, según la reivindicación 1, en la que dicho URP tiene más de un 5% de glutamato (E) y comprende menos de un 2% de arginina (R) o lisina (K) .

9. Proteína, según la reivindicación 1, en la que cualquier tipo de los aminoácidos solos seleccionados del grupo que consiste en glicina (G) , aspartato (D) , alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) y prolina (P) constituye más de aproximadamente el 20% de los aminoácidos totales del URP.

10. Proteína, según la reivindicación 9, en la que cualquier tipo de los aminoácidos solos seleccionados del grupo que consiste en glicina (G) , aspartato (D) , alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) y prolina (P) constituye más de aproximadamente el 30% de los aminoácidos totales del URP.

11. Proteína, según la reivindicación 9, en la que los residuos de glicina contenidos en el URP constituyen al menos aproximadamente el 20% de los aminoácidos totales de la URP.

12. Proteína, según la reivindicación 1, en la que el URP comprende más de aproximadamente 100 aminoácidos contiguos.

13. Proteína, según la reivindicación 1, en la que el URP comprende más de aproximadamente 200 aminoácidos contiguos.

14. Polinucleótido recombinante que comprende una secuencia codificante que codifica la proteína de fusión según

la reivindicación 1.

15. Célula huésped que comprende el polinucleótido recombinante según la reivindicación 14. 5