Plantas que tienen mayor rendimiento y un método para su elaboración.

Un método para incrementar el rendimiento de semillas con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre,

que comprende la introducción a través de la transformación de la planta y la sobreexpresión en una planta de un ácido nucleico, que codifica un polipéptido similar a OsMADS18, en donde el polipéptido similar a OsMADS18:

(i) es un factor de transcripción de la caja MADS tipo II de monocotiledónea del clado SQUAMOSA; y

(ii) tiene actividad de enlazamiento de ADN y de proteína; y

(iii) comprende el motivo LPPWMLRT (SEQ ID NO: 18) en los últimos 15 aminoácidos del terminal C de la proteína, lo que permite una sustitución de aminoácidos en cualquier parte del motivo pero no en la segunda y en la cuarta posiciones; y

(iv) tiene al menos 65% de identidad de secuencia con la proteína OsMADS18 de la SEQ ID NO: 2.

Plantas que tienen mayor rendimiento y un método para su elaboración La presente invención se refiere en general al campo de la biología molecular y se refiere a un método para aumentar el rendimiento de las plantas en relación con las correspondientes plantas de tipo silvestre. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para aumentar rendimiento de semillas por parte de la planta mediante el incremento de la actividad en una planta de un polipéptido tipo MADS18 de Or y za sativa (Os) o un homólogo del mismo. La presente invención también se refiere a plantas que tienen una mayor actividad de un polipéptido tipo OsMADS18 o un homólogo del mismo, cuyas plantas tienen mayor rendimiento de semilla con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre. La invención también proporciona construcciones útiles en los métodos de la invención.

La población mundial en continuo crecimiento y la disminución de la oferta de tierras cultivables disponibles para la agricultura estimula la investigación para mejorar la eficiencia de la agricultura. Los medios convencionales para mejoras hortícolas y de los cultivos utilizan técnicas selectivas de fitomejoramiento para identificar plantas con características deseables. Sin embargo, tales técnicas selectivas de fitomejoramiento presentan diferentes inconvenientes, a saber, que estas técnicas son típicamente de labor intensiva y resultan en plantas que a menudo contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre pueden resultar en el rasgo deseable que pasa desde las plantas progenitoras. Los avances en biología molecular han permitido a la humanidad modificar el germoplasma de animales y plantas. La ingeniería genética de las plantas implica el aislamiento y manipulación de material genético (típicamente en la forma de ADN o ARN) y la posterior introducción de ese material genético en una planta. Tal tecnología tiene la capacidad de suministrar cultivos o plantas que tienen diferentes rasgos económicos, agronómicos u hortícolas mejorados.

Un rasgo de interés económico particular es el rendimiento. El rendimiento se define normalmente como el producto medible de valor económico de un cultivo. Esto se puede definir en términos de cantidad y/o calidad. El rendimiento es directamente dependiente de diferentes factores, por ejemplo, el número y tamaño de los órganos, la arquitectura de la planta (por ejemplo, el número de ramas) , la producción de semillas y más. El desarrollo de las raíces, la absorción de nutrientes y la tolerancia al estrés también pueden ser factores importantes en la determinación del rendimiento. La optimización uno de los factores antes mencionados puede aumentar por lo tanto el rendimiento del cultivo.

La capacidad para aumentar el rendimiento de la planta podría tener muchas aplicaciones en áreas tales como la agricultura, incluida la producción de plantas ornamentales, la arboricultura, la horticultura y la silvicultura.

Ahora se ha encontrado que el aumento de la actividad en una planta de un polipéptido similar a OsMADS18 produce plantas que tienen mayor rendimiento de semillas con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre.

Los genes de la caja MADS (MCM1 en la levadura, Agamous y Deficiens en las plantas, y SRF (factor de respuesta al suero) en humanos) constituyen una gran familia de genes de reguladores transcripcionales eucariotas involucrados en diversos aspectos del desarrollo de levaduras, plantas y animales. Los genes de la caja MADS codifican un dominio MADS fuertemente conservado responsable por el enlazamiento del ADN con cajas específicas en la región reguladora de sus genes objetivo. La familia de genes se puede dividir en dos linajes principales, el tipo I y el tipo II. Los genes de tipo II también se denominan proteínas de tipo MIKC, que hacen referencia a los cuatro dominios funcionales que poseen (véase la Figura 1, de Jack (2001) Plant Molec Biol. 46: 515 - 520) :

-MADS para el enlazamiento de ADN, aproximadamente de 60 aminoácidos (altamente conservados) localizados en el extremo del terminal N de la proteína;

-I para el dominio interviniente (menos conservado) , implicado en la formación selectiva del dímero MADS;

-K para el dominio de queratina (bien conservado) responsable de la dimerización;

-C para la región del terminal C (variable en secuencia y longitud) implicada en la activación transcripcional, o en la formación de un complejo multimérico del factor de transcripción.

Más de 100 genes de la caja MADS han sido identificados en Arabidopsis, y han sido clasificados filogenéticamente en 12 clados, teniendo cada clado desviaciones específicas del consenso de MADS (Thiessen et al., (1996) J Mol Evol 43: 484 - 516) . OsMADS18 (anteriormente llamado FDRMADS7 o OsMADS28) pertenece al clado SQUA (para SQUAMOSA, de Antirrhinum majus) , junto con los siguientes genes de Arabidopsis: FUL/Agl8 (FRUITFULL) , CAL/Agl10 (CAULIFLOWER) , AP1/Agl7 (APETALA1) y el menos caracterizado MADS AGL79. Los genes del clado SQUA son genes para identificación del órgano de la función A con referencia al modelo para especificación de la identidad del órgano floral ABC como lo propusieron Coen y Meyerowitz en 1991 (Nature 353: 31 - 7) . El arroz posee cuatro genes del grupo A: OsMADS14, OsMADS15, OsMADS18 y OsMADS20, siendo cada uno miembro del clado SQUA.

El clado SQUA en dicotiledóneas se subdivide en dos subgrupos, los subclados AP1 y FUL. Estos subclados divergen esencialmente con respecto a los motivos de aminoácidos específicos ubicados en el terminal C de sus respectivas proteínas (Litt y Irish (2003) Genetics 165: 821 - 833) . Además de la presencia de un motivo de aminoácidos específicos de AP1, las proteínas relacionadas con el clado AP1 de dicotiledóneas usualmente comprenden un motivo farnesilación en su terminal C (este motivo es CAAX, donde C es cisteína, A es usualmente un aminoácido alifático, y X es metionina, glutamina, serina, cisteína o alanina) . En monocotiledóneas, las proteínas del clado SQUA también se subdividen en dos grupos principales, que pueden distinguirse con base en motivos conservados del terminal C localizados dentro de los últimos 15 aminoácidos de las proteínas: LPPWMLRT (SEQ ID NO: 18) y LPPWMLSH (SEQ ID NO: 19) (Figura 2) . En contraste con las secuencias de dicotiledóneas del clado SQUA, las secuencias de monocotiledóneas del clado SQUA no poseen un motivo farnesilación en su terminal C.

OsMADS18 se agrupa con el polipéptido ZMM28 del maíz y el polipéptido m3 de la cebada (Becker y Thiessen (2003) Mol Phylogenet Evol 29 (3) : 464 - 89) . Las tres proteínas incluyen el motivo de aminoácidos LPPWMLRT aproximadamente dentro de los últimos 15 aminoácidos de su terminal C. Otras dos proteínas de la caja MADS del arroz del clado SQUA, OsMADS14 y OsMADS15, pertenecen al subclado con el motivo LPPWMLSH aproximadamente dentro de los últimos 15 aminoácidos de su terminal C. Para ambos de estos motivos, LPPWMLRT (SEQ ID NO: 18) y LPPWMLSH (SEQ ID NO: 19) , los aminoácidos más conservados se localizan en la segunda (P para prolina) y cuarta posiciones (W para triptófano) .

OsMADS18 es un gen ampliamente expresado y su ARN puede ser detectado en raíces, hojas, inflorescencia y tejido de la semilla en desarrollo (Masiero et al. (2002) J. Biol. Chem. 277 (29) : 26429 - 35) . OsMADS18 puede estar implicado en la transición del crecimiento vegetativo hasta la floración (Fornara et al. (2004) Plant Physiol 135 (4) : 2207 - 19) . La sobreexpresión constitutiva de OsMADS18 en arroz conduce a plantas enanas y a una floración temprana como consecuencia de una maduración acelerada de la planta.

En experimentos de doble híbrido en levadura, OsMADS18 ha demostrado que forma heterodímeros con OsMADS6, OsMADS24, OsMADS45 y OsMADS47. También interactúa específicamente con OsNF-YB1, que comparte la identidad de secuencia más alta con el Cotiledón Frondoso 1 de Arabidopsis (LEC1 o AtNF-YB9) . También se ha demostrado la formación del complejo ternario entre las tres proteínas OsMADS18, OsMADS6 y OsNF-YB1 (Masiero et al., (2002) J. Biol. Chem. 277 (29) : 26429 - 35) .

En la patente de los Estados Unidos No. 6.229.068 B1, Yanofsky et al., describen un método para aumentar el tamaño de la semilla (o fruto) en una planta mediante el uso de un producto génico relacionado con AGL8 y que lo expresa ectópicamente en la planta. Los elementos reguladores preferidos mencionados en el documento para la expresión ectópica de un producto génico relacionado con AGL8 son elementos constitutivos, preferidos de la semilla o inducibles.

La solicitud internacional de patente WO 02/33091 da a conocer un factor de transcripción de la caja... [Seguir leyendo]

1. Un método para incrementar el rendimiento de semillas con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre, que comprende la introducción a través de la transformación de la planta y la sobreexpresión en una planta de un ácido nucleico, que codifica un polipéptido similar a OsMADS18, en donde el polipéptido similar a OsMADS18:

(i) es un factor de transcripción de la caja MADS tipo II de monocotiledónea del clado SQUAMOSA; y

(ii) tiene actividad de enlazamiento de ADN y de proteína; y

(iii) comprende el motivo LPPWMLRT (SEQ ID NO: 18) en los últimos 15 aminoácidos del terminal C de la proteína, lo que permite una sustitución de aminoácidos en cualquier parte del motivo pero no en la segunda y en la cuarta posiciones; y

(iv) tiene al menos 65% de identidad de secuencia con la proteína OsMADS18 de la SEQ ID NO: 2.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho ácido nucleico es una porción de un ácido nucleico similar a OsMADS18 de al menos 747 nucleótidos, cuya porción codifica un factor de transcripción de la caja MADS tipo II de monocotiledónea del clado SQUAMOSA de al menos 249 aminoácidos, que tiene actividad de enlazamiento de ADN y de proteína y que comprende:

(i) el motivo LPPWMLRT (SEQ ID NO: 18) en los últimos 15 aminoácidos del terminal C de la proteína, lo que permite una sustitución de aminoácidos en cualquier parte del motivo pero no en la segunda y en la cuarta posiciones; y/o

(ii) tener al menos 65% de identidad de secuencia con la proteína OsMADS18 de la SEQ ID NO: 2.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho ácido nucleico es una secuencia capaz de hibridar de forma rigurosa con un ácido nucleico similar a OsMADS18, cuya secuencia de hibridación o complemento de la misma codifica un factor de transcripción de la caja MADS tipo II de monocotiledónea del clado SQUAMOSA que tiene actividad de enlazamiento de ADN y de proteína y que comprende:

(i) el motivo LPPWMLRT (SEQ ID NO: 18) en los últimos 15 aminoácidos del terminal C de la proteína, lo que permite una sustitución de aminoácidos en cualquier parte del motivo pero no en la segunda y en la cuarta posiciones; y/o

(ii) tener al menos 65% de identidad de secuencia con la proteína OsMADS18 de la SEQ ID NO: 2.

4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho ácido nucleico aislado similar a OsMADS18 es de una planta monocotiledónea.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho ácido nucleico codifica un ortólogo o un parálogo de una proteína OsMADS18 de la SEQ ID NO: 2, comprendiendo dicho ortólogo o dicho parálogo las siguientes características:

(i) es un factor de transcripción de la caja MADS tipo II de monocotiledónea del clado SQUAMOSA; y

(ii) tiene actividad de enlazamiento de ADN y de proteína; y

(iii) comprende el motivo LPPWMLRT (SEQ ID NO: 18) en los últimos 15 aminoácidos de la proteína, lo que permite una sustitución de aminoácidos en cualquier parte del motivo pero no en la segunda y en la cuarta posiciones; y

(iv) tiene al menos 65% de identidad de secuencia con la proteína OsMADS18 de la SEQ ID NO: 2.

6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho ácido nucleico similar a OsMADS18 está operativamente enlazado a un promotor del meristemo apical del vástago temprano.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho promotor del meristemo apical del vástago temprano es un promotor OSH1.

8. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho mayor rendimiento de semilla se selecciona de uno cualquiera o más de: (i) mayor peso de mil granos (TKW) ; (ii) mayor tamaño de la semilla; (iii)

mayor volumen de la semilla; (iv) mayor área de la semilla; (v) mayor longitud de la semilla; y (vi) mayor biomasa de la semilla.

9. Constructo que comprende:

(a) un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar a OsMADS18, cuyo polipéptido similar a OsMADS18:

(i) es un factor de transcripción de la caja MADS tipo II de monocotiledónea del clado SQUAMOSA; y

(ii) tiene actividad de enlazamiento de ADN y de proteína; y

(iii) comprende el motivo LPPWMLRT (SEQ ID NO: 18) en los últimos 15 aminoácidos del terminal C de la proteína, lo que permite una sustitución de aminoácidos en cualquier parte del motivo pero no en la segunda y en la cuarta posiciones; y

(iv) tiene al menos 65% de identidad de secuencia con la proteína OsMADS18 de la SEQ ID NO: 2; y

(b) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (a) , en donde dicha secuencia de control es un promotor del meristemo apical del vástago temprano.

10. Constructo de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicho promotor del meristemo apical del vástago temprano es un promotor OSH1.

11. Constructo de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho promotor OSH1 es como el representado por la SEQ D NO: 22.

12. Constructo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para uso en un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

13. Plantas que comprenden un constructo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.

14. Un método para la producción de una planta transgénica que tiene mayor rendimiento de semillas con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre, cuyo método comprende:

(a) introducir a través de la transformación de la planta y expresión en una planta, parte de una planta o célula de una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar a OsMADS18 operativamente enlazado a un promotor del meristemo apical del vástago temprano, cuyo polipéptido similar a OsMADS18:

(i) es un factor de transcripción de la caja MADS tipo II de monocotiledónea del clado SQUAMOSA; y

(ii) tiene actividad de enlazamiento de ADN y de proteína; y

(iii) comprende el motivo LPPWMLRT (SEQ ID NO: 18) en los últimos 15 aminoácidos del terminal C de la proteína, lo que permite una sustitución de aminoácidos en cualquier parte del motivo pero no en la segunda y en la cuarta posiciones; y

(iv) tiene al menos 65% de identidad de secuencia con la proteína OsMADS18 de la SEQ ID NO: 2; y

(b) cultivar la célula de la planta bajo condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta.

15. Una planta transgénica que tiene mayor rendimiento de semillas con respecto a las correspondientes plantas de tipo silvestre, resultante de la transformación de una planta con un ácido nucleico operativamente enlazado a un promotor del meristemo apical del vástago temprano, cuyo ácido nucleico codifica un polipéptido similar a OsMADS18 que:

(i) es un factor de transcripción de la caja MADS tipo II de monocotiledónea del clado SQUAMOSA; y

(ii) tiene actividad de enlazamiento de ADN y de proteína; y

(iii) comprende el motivo LPPWMLRT (SEQ ID NO: 18) en los últimos 15 aminoácidos del terminal C de la proteína, lo que permite una sustitución de aminoácidos en cualquier parte del motivo pero no en la segunda y en la cuarta posiciones; y

(iv) tiene al menos 65% de identidad de secuencia con la proteína OsMADS18 de la SEQ ID NO: 2.

16. Una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 13 o 15, en donde dicha planta es una planta monocotiledónea.

17. Partes cosechables de una planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13, 15 o 16, que

comprenden un ácido nucleico similar a OsMADS18 que codifica un polipéptido similar a OsMADS18 que comprende las siguientes características:

(i) es un factor de transcripción de la caja MADS tipo II de monocotiledónea del clado SQUAMOSA; y

(ii) tiene actividad de enlazamiento de ADN y de proteína; y

(iii) comprende el motivo LPPWMLRT (SEQ ID NO: 18) en los últimos 15 aminoácidos de la proteína, lo que permite 10 una sustitución de aminoácidos en cualquier parte del motivo pero no en la segunda y en la cuarta posiciones; y

(iv) tiene al menos 65% de identidad de secuencia con la proteína OsMADS18 de la SEQ ID NO: 2, en donde dicho ácido nucleico similar a OsMADS18 está operativamente enlazado al promotor del meristemo apical del vástago temprano.

18. Partes cosechables de acuerdo con la reivindicación 17, en donde dichas partes cosechables son semillas.

19. El uso de un ácido nucleico/gen similar a OsMADS18 en el aumento del rendimiento de semillas, dicho ácido nucleico/gen codificando un polipéptido similar a OsMADS18 de acuerdo con la reivindicación 1 (i) hasta (iv) , o el uso de un polipéptido similar a OsMADS18 de acuerdo con la reivindicación 1 (i) hasta (iv) , en el aumento del rendimiento de semillas.

20. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicho rendimiento de semillas incluye uno o más de lo siguiente: mayor TKW, mayor tamaño de la semilla, mayor volumen de la semilla, mayor área de la semilla, mayor longitud de la semilla y mayor biomasa de la semilla.

seq id no. 01: ADN de OsMADS18 de Or y za sativa (091458)

seq id no 02: proteína OsMADS18 de Or y za sativa

seq id no 03: ADN de ZMM28 (o m28) de Zea mays (AJ430695)

FIGURA 5

seq id no 04: Proteína ZMM28 de Zea mays

seq id no 05: ADN de MADS3 de Lolium perenne (AY198328)

seq id no 06: Proteína MADS3 de Lolium perenne

FIGURA 5 (continuación)

seq id no 07: ADN de m3 de Hordeum vulgare (AJ249143)

seq id no 08: Proteína m3 de Hordeum vulgare

seq id no 09: ADN parcial similar a ZMM28 de Saccharum officinarum (EST CA285442)

FIGURA 5 (continuación)

seq id no 10: ADN parcial similar a ZMM28 de Saccharum officinarum (EST CA200888)

seq id no 11: ADN parcial similar a ZMM28 de Saccharum officinarum (EST CA247266)

seq id no 12: ADN parcial similar a ZMM28 de Saccharum officinarum (EST CA282968)

FIGURA 5 (continuación)

seq id no 13: ADN parcial similar a ZMM28 de Saccharum officinarum (EST CA299090)

seq id no 14: ADN reconstituido similar a ZMM28 de Saccharum officinarum, versión 1 (cambia con la seq id no 16 en negrita)

seq id no 15: ADN reconstituido similar a ZMM28 de Saccharum officinarum, versión 1 (cambia con la seq id no 17 en negrita)

FIGURA 5 (continuación)

seq id no 16: ADN reconstituido similar a ZMM28 de Saccharum officinarum, versión 2 (cambia con la seq id no 14 en negrita)

seq id no 17: ADN reconstituido similar a ZMM28 de Saccharum officinarum, versión 2 (cambia con la seq id no 15 en negrita)

seq id no 18: Consenso de aminoácidos del motivo del terminal C de monocotiledóneas RT

LPPWMLRT

seq id no 19: Consenso de aminoácidos del motivo del terminal C de monocotiledóneas SH

LPPWMLSH

seq id no 20: secuencia de nucleótidos del cebador prm05821

seq id no 21: secuencia de nucleótidos del cebador prm05822

FIGURA 5 (continuación)

seq id no 22: secuencia del nucleótido del promotor OSH1

FIGURA 5 (continuación)