Plantas no transgénicas resistentes a los herbicidas.

Método para la producción de una planta no transgénica. que esresistente o tolerante a un herbicida de la familia de lafosfonometilglicina comprendiendo:

(a) fa introducción en células vegetales de una oligonuc/eobaserecombinagénica con una mutación objetivo en el gen EPSPSpara producir células vegetales con un gen EPSPS mutante queexpresa una proteína EPSP que es mutada en una o másposiciones de aminoácidos, dichas pOSICiones siendoseleccionadas en el grupo que consiste en leu173. Alau9. Met1eo.Arg,8f. Ser98. Ser255 y leul98 en fa proteína EPSPS deArabidopsis o en un residuo de aminoácido análogo en un genEPSP de otra especie;

(b) la identificación de una célula vegetal que presenta uncrecimiento nonnal, en comparación con una célula vegetal detipo salvaje correspondiente en presencia de glifosato; y

(e) la regeneración de una planta no transgénica resistente otolerante al herbicida que posee dicho gen EPSPS mutado apartir de dicha célula vegetal;

donde la planta no transgénica. resistente o tolerante al herbicida exhibeun crecimiento y desarrollo normales en comparación con el de lasplantas correspondientes de tipo salvaje y donde la enzima EPSPSmutada tiene la misma actividad catalftíca en comparación con la de laenzima de tipo salvaje.

1. CAMPO DE LA INVENCiÓN [0001] La presente invención se refiere a la producción de una planta no transgénica resistente o tolerante a un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina. por ejemplo. glifosato. La presente invención también se refiere al uso de una oligonucleobase recombinagénica para que se realice una mutación deseada en las secuencias cromosómicas o episómicas de una planta en el gen codificante con respecto a una 5-enol piruvil-shikimato-3fosfato síntasa (EPSPS) . La proteína mutada. Que mantiene sustancialmente la actividad catalítica de la proteína de tipo salvaje, permite una mayor resistencia o tolerancia de la pJanta frente a un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina. y permite el crecimiento o desarrollo sustancialmente normales de la planta. de sus órganos. tejidos o células en comparación con la planta de tipo salvaje independientemente de la presencia o ausencIa del herbicida. La presente invención también se refiere a una célula vegetal no transgénica en la que ha mutado el gen EPSPS. una planta no transgénica regenerada a partir de ahí. asi como una planta obtenida mediante un cruce utilizando una planta regenerada no transgénica con un gen EPSPS mutado.

2. ANTECEDENTES DE lA INVENCiÓN

2.1 HERBiCiDAS DE FOSFONOMETHILGLlCINA r0002] Las plantas tolerantes al herbicida pueden reducir la necesidad de trabajar el suelo para controJar las malas hierbas reduciendo así eficazmente la erosión del suelo. Un herbicida objeto de mucha investigación a este respecto es la N.fosfonometilglicina. comúnmente denominada glifosato. El glifosato inhibe la via ácida shiquimica que conduce a la biosíntesis de compuestos aromáticos incluyendo aminoacidos, hormonas y vitaminas. Especificamente. el glifosato frena la conversión de ácido fosfoenolpirúvico (PEP) y ácido 3fosfoshiquimico en ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquimico por la inhibición del enzimático 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (a partir de ahora denominado sintasa EPSP o EPSPS) . Para los objetivos de la presente invención, el término "glifosato" incluye cualquier forma eficaz herbicida mente de la N-fosfonometilgticina (incluyendo cualquier derivado de sal, otras formas con las que se obtiene la producción del ión glifosato en plantas y cualesquiera otras herbicidas de la familia de la fosfonometliglicina.

[0003J La tolerancia de las plantas al glifosato puede aumentar con la introducción de un gen mutante EPSPS que tiene una alteración en la secuencia codiflcante de los aminoácidos EPSPS en el gen ama de la planta. Ejemplos de algunas de las mutaciones en el gen EPSPS para inducir la tolerancia al 9lif05ato se describen en las siguientes patentes: patente EEUU n°, 5.310, 667: patente EEUU n°. 5, 866.775; patente EEUU n°. 5, 312, 910; patente EEUU n°. 5.145, 783. Estas mutaciones propuestas habitualmente tienen un valor k; más alto para el glifosato que la enzima EPSPS de tipo salvaje que confiere el fenotipo tolerante al glifosato. pero éstas variantes también se caracterizan por un Km alto de PEP con el que la enzima cinéticamente se vuelve menos eficiente. (Kishore et al .. 1988. Ann. Rev. Biochem. 57:627-663; SchuJz et Al .. 1984, Arch. Microbio/. 137: 121-123; Sost et Al.. 1984. FEBS.lett 173: 238-241; Kishore et al.. 1986. Fed.Proc. 45: 1506; Sost y Arnrhein. 1990, Arch.Biochem. Biophys. 282: 433-436.) Muchas mutaciones del gen EPSPS son elegidas con el fin de producir una enzima EPSP que sea resistente a herbicidas, pero desafortunadamente, la enzima EPSPS que produce el gen EPSPS mutado tiene una actividad enzímática significativamente inferior al EPSPS de tipo salvaje. Por ejemplo. el Km aparente de PEP y el K¡ aparente de glifosato para el EPSPS de tipo salvaje de Ecoli son de 10 ~M Y 0.5 IJM. mientras que para un aislado tolerante al glifosato que tiene una sola sustitución de aminoácidos de alanina con respecto a la glicina en posición 96. estos valores son de 220 IJM Y 4.0 mM. respectivamente. Un numero de genes EPSPS tolerantes al glifosato se han construido por mutagénesis. De nuevo. el EPSPS tolerante al glifosato presentaba una eficiencia catalítica inferior (Vmalf IKm) . como lo mostraba un incremento en el Km de PEP, Y una ligera reducción del V max de la enzima vegetal de tipo salvaje (Kishore et al., 1988, Ann.Rev. Biochem. 57:627-663) . [0004) Como las constantes cinéticas de las enzimas variantes se deterioran con respecto al PEP, se han propuesto unos niveles altos de sobreproducción de la enzima variante, de 40 a 80 veces más. que serán necesarios para mantener una actividad catalftica normal en plantas en presencia de glifosato (Kishore et al.. 1988, Ann.Rev. Biochem. 57:627-663) . Se ha demostrado que se pueden producir plantas tolerantes al glifosato por inserción en el genoma de la planta de la capacidad para producir un nivel más alto de EPSP sintasa en el cloroplasto de la céfula (Shah et al., 1986. Science 233. 478-481) , cuya enzima es preferiblemente tolerante al glifosato (Kishore et a/.. 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663) . [0005] la introducción de fos genes EPSPS mutantes exógenos en plantas está bien documentada. Por ejemplo, según la patente EEUU n°. 4.545.060, para incrementar la resistencia de una planta al glifosato. un gen codificante para una variante EPSP que tiene al menos una mutación que hace que la enzima sea más resistente a su inhibidor competitivo. es decir, glifosato, es introducido en el genoma de la planta. No obstante. se asocian muchas complicaciones y problemas con estos ejemplos. Muchas de dichas mutaciones producen una expresión baja del producto genético EPSPS mutado

o produce un producto genético EPSPS con una actividad enzimatica significativamente inferior en comparación con el tipo salvaje. La expresión baja

o actividad enzimática baja de la enzima mutada produce niveles anormalmente bajos de crecimiento y de desarrollo de la planta. [0006) Mientras Que estas varíantes en las EPSP sintasas han demostrado ser útiles en la obtendón de plantas transgénicas tolerantes al glifosato. sería mucho más beneficioso obtener una variante de producto genético EPSPS altamente tolerante al glifosato pero que siga eficiente cinéticamente para que la tolerancia mejorada pueda ser obtenida con un nivel de expresión de tipo salvaje.

2.2 OUGONUCLEOBASES RECOMBINAGÉNICAS [0007] Las oJigonucleobases recombinagénicas y su uso para efectuar cambios genéticos en células eucarióticas se describen en la patente estadounidense n°. 5.565, 350 de Kmiec (Kmiec 1) . Kmíec I enseña un método para la introducción de alteraciones genéticas especificas en un gen objetivo. Kmiec I divulga. entre otras cosas. oligonucleobases recombinagénicas que tienen dos cadenas, en las que la primera cadena contiene dos segmentos de al menos 8 nucJe6tidos de tipo ARN que son separados por un tercer segmento desde 4 hasta aproximadamente 50 nucleótidos de tipo ADN. llamado "segmento de ADN interpuesto. ti Los nuc/eótidos de la primera cadena en apareamiento de bases de nucleótidos de tipo ADN de una segunda cadena. Las primeras y segundas cadenas son enlazadas adicionalmente por un segmento de nucleótidos monocatenario de modo que las primera y segunda cadenas son partes de una única cadena oligonucleótida. Kmiec I enseña además un método para la introducción de alteraciones genéticas específicas en un gen objetivo. Según Kmiec l. las secuencias de los segmentos RNA son seleccionadas para ser homólogas, es decir. idénticas, a la secuencia de un primer y de un segundo fragmento del gen objetivo. La secuencia del segmento interpuesto de AON es homóloga a la secuencia del gen objetivo entre el

primer y el segundo fragmento excepto para una región de diferencia. llamada "region heleróloga." la región heteróloga puede efectuar una inserción o deleción. o puede contener una o más bases que no coinciden con la secuencia del gen objetivo con el fin de efectuar una sustitución. Según Kmiec

" la secuencia del gen objetivo es alterada en forma dirigida por la región heteróloga, de manera que el gen objetivo se vuelve homólogo con la secuencia de la oligonucleobase recombinagénica. Kmiec , enseña específicamente que los nucleótidos que contienen ribosa y 2'·O-metilribosa, es decir 2'-metoxiribosa, pueden ser usados en las oligonucleobases recombínagénicas y nucleótidos que contienen deoxlribosa de origen natural.

pueden ser utilizados como nucleófidos de tipo AON.

(0008] La patente EEUU nC • 5.731. 181 para Kmiec (Kmiec 11) divulga especificamente el uso de oligonucleobases recombinagénicas para efectuar cambios genéticos en células vegetales y divulga otros ejemplos de análogos y derivados de nucleótidos tipo ARN... [Seguir leyendo]

1. Método para la producción de una planta no transgénica. que es resistente o tolerante a un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina comprendiendo:

(a) fa introducción en células vegetales de una oligonuc/eobase recombinagénica con una mutación objetivo en el gen EPSPS para producir células vegetales con un gen EPSPS mutante que expresa una proteína EPSP que es mutada en una o más posiciones de aminoácidos, dichas pOSICiones siendo seleccionadas en el grupo que consiste en leu173. Alau9. Met1eo. Arg, 8f. Ser98. Ser255 y leul98 en fa proteína EPSPS de Arabidopsis o en un residuo de aminoácido análogo en un gen EPSP de otra especie;

(b) la identificación de una célula vegetal que presenta un crecimiento nonnal, en comparación con una célula vegetal de tipo salvaje correspondiente en presencia de glifosato; y

(e) la regeneración de una planta no transgénica resistente o tolerante al herbicida que posee dicho gen EPSPS mutado a partir de dicha célula vegetal;

donde la planta no transgénica. resistente o tolerante al herbicida exhibe un crecimiento y desarrollo normales en comparación con el de las plantas correspondientes de tipo salvaje y donde la enzima EPSPS mutada tiene la misma actividad catalftíca en comparación con la de la enzima de tipo salvaje.

2. Método para la producción de una planta no transgénica, que es resistente o tolerante a un herbicida de la familia de la fosfonometilgilcina, comprendiendo:

(a) la introducción en células vegetales de una oligonucleobase recombinagénica con una mutación objetivo en el gen EPSPS para producir células vegetales con un gen mutante EPSPS que expresa una proteina mutante EPSPS que es mutada en una o más posiciones de aminoácidos, dichas posiciones siendo seleccionadas en el grupo que consiste en leu113. Alau9. Met'80. Arg181. Serga, Ser255 y leul98 en la proteina Arabidopsis EPSPS o en un residuo análogo de aminoácido en un gen EPSP de otra especie;

(b) la identificación de una célula vegetal que posee una proteina EPSPS mutante que tiene la misma actividad catalítica en comparación con una proteína EPSPS correspondiente de tipo salvaje en presencia de glifosato: y

(c) la regeneración de una planta no transgénica resistente o tolerante al herbicida que posee dicho gen EPSPS mutado a partir de dicha célula vegetal:

donde la planta no transgénica resistente o tolerante al herbicida exhibe un crecimiento y desarrollo normal en comparación con el de fas plantas correspondientes de tipo salvaje. y donde la enzima EPSPS mutada tiene la misma actividad catalítica en comparación con la de la enzima de tipo salvaje.

3. Método según la reivindicación 1 o 2 en el que la oligonucleobase recombinagénica es un nucleótido dúplex mezclado o un vector mutacional de otigodeoxinucleótido monocatenario (SSMOV) .

4. Método según la reivindicación 3 en el que el nucleótido dúplex mezclado contiene una primera región homóloga que tiene una secuencia idéntica a la secuencia de al menos 6 pares de bases del primer fragmento del gen EPSPS objetivo y una segunda región homóloga que tiene una secuencia idéntica a la secuencia de al menos 6 pares de bases de un segundo fragmento del gen EPSPS objetivo, y una región intermedia que contiene al menos una nucleobase heteróloga al gen EPSPS objetivo. la cual región intermedia conecta las primera y segunda regiones homÓlogas.

5. Método según la reivindicación 1 o 2 en el que la oligonucleobase recombinagénica es introducida por electroporación.

6. Método según la reivindicación 1 en el que las posiciones de aminoácidos son seleccionadas en el grupo que consiste en Leu97. Ala103. Met104. Argl05. Ser23. Ser179 y leu122 en el gen EPSPS de lea mays.

7. Método según la reivindicación 1 en el que las posiciones de aminoácidos son seleccionados en el grupo que consiste en Leu169,

Ala1í5. Met176. Arg171, Ser94. SerZ5t y LeUt94 en el gen EPSPS de una especie de Brassica.

8. Método según la reivindicación 1 en el que las pOSIcIones de aminoácidos son seleccionadas en el grupo que consiste en Leu, 69. Alat75. Met176. Arg177 Ser94. Ser251 y Leu94 en el gen EPSPS de Petunia hybrída.

9. Método según la reivindicación 1 o 2 en el que las células vegetales son seleccionadas en el grupo que consiste en maíz. trigo. arroz. cebada. semilla de soja. algodón. remolacha azucarera, colza. canola, lino, girasol. patata. tabaco, tomate. alfalfa. álamo, pino. eucalipto. manzano. lechuga. guisantes. lentejas. uva. césped y especie de Brassica.

10. Método según la reivindicación 2 en el que las posiciones de aminoácidos son seleccionadas en el grupo que consiste en Leu97. Ala'03 Met, 04. Arg , 0S• Ser2l. Ser119 y Leul22 en el gen EPSPS de lea

mays.

11. Método según la reivindicación 2 en el que las posiciones de aminoácidos son seleccionadas en el grupo que consiste en Leu, 69, Ala175, Melt176. Arg1T7. Ser94. Ser251 y Leu194 en el gen EPSPS de una especie de Brassica.

12. Método segun la reivindicación 2 en el que las posiciones de aminoácidos son seleccionadas en el grupo que consiste en Leu189, Ala175, Met176, Argl77. Ser94. Ser251 y LeUt94 en al gen EPSPS de Petunia hybrida.

13. Método para la producción de una planta no transgénica que es resistente o tolerante a un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina comprendiendo:

(a) la introducción en células vegetales de una oligonucleobase recombinagénica con una mutación objetivo en el gen EPSPS para producir células vegetales con un gen EPSPS mutante que expresa una proteína EPSP que es mutada en dos posiciones de aminoácidos. dichas posiciones siendo seleccionadas en el grupo que consiste en Thr'78 y Pro182. en la proteina EPSPS de Arabidopsis o en un residuo de aminoácido análogo en un gen EPSP de otra especie donde el Thr178 es sustituido por Val o Leu y Pr0182 es sustituido por Ser;

(b) la identificación de una célula vegetal que presenta un crecimiento normal en comparación con una célula vegetal de tipo salvaje correspondiente en presencia de glifosato: y

(c) la regeneración de una planta no transgénica. resistente o tolerante al herbicida que tiene dicho gen EPSPS mutado de dicha célula vegetal;

donde la planta no transgénica. resistente o tolerante al herbicida exhibe un crecimiento y desarrollo normales en comparación con el de las plantas correspondientes de tipo salvaje. y donde la enzima EPSPS mutada tiene fa misma actividad catalítica en comparación con la de la enzima de tipo salvaje.

14. Método según la reivindicación 13 en el que las posIciones de aminoácidos son Thr'02 y Pro106 en el gen EPSPS de lea mays.

15. Método según la reivindicación 13 en el que las pOSICiones de aminoácidos son Thrl1 .. y Pro170 en el gen EPSPS de una especie de Brassica.

16. Método según la reivindicación 13 en el que las posiciones de aminoacidos son Thr174 y Pr0t78 en el gen EPSPS de Petunía hybrida.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCiÓN

Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.

Documentos de patente citados en la descripción US 5310667 A [0003] US 5866775 A [0003] US 5312910 A (0003] US 5145783 A (0003) US 4545060 A (0005) US 5565350 A, Kmiec [0007] [0012] (0029] [0034] US 5731181 A, Kmiec (0008] [0012] [0029] [0034] US 5756325 A [0008) [0012] [0029] [0035] (0043] US 5871984 A [0008] [0012] [0029] [0035] (0043] US 5760012 A (0008] [0012] [00291 [0035] (0043] US 5888983 A (0008] [0012] [0029] (0035] [0043] US 5795972 A [0008] (0012] [0029] (0035] (0043] US 5780296 A (0008] [0012] (0029] (0035) (0043] US 5945339 A [0008] (0012) [0029] [0035] [0043] US 6004804 A [0008] [0012] (0029) [0035] [0043] US 6010907 A [0008] [0012] [0029] (0035) [0043) US 0023457 W [0008] [0012] [0029J [0035] [0043]

WO 9849350 A [0008J [0012] [0029] [0035] [0043] WO 9907865 A [0008] [0012] [0029] [0035] [0043] [0060] WO 9958723 A [0008] [0012] [0029] [0035] (0043] WO 9958702 A [0008] (0012] [0029] [0035] (0043] WO 9940789 A (0008] (0012) [0029] (0035) [0043] US 5334711 A (0036] EP 629387 A [0036] EP 679657 A [0036J US 4945050 A [0059] US 5100792 A (0059)

US 5204253 A [0059] US 5302523 A, Coffee [0061] US 60158027 B. 1999 [0081] US 60173564 B, 1999 [0081]

Galfois et al. Methods in Molecular Biology Humana Press1996. vol. 55, 89-107 [0063] Kipp et al. Methods in Molecular Biology Humana Press1999. vol. 133, 213-221 [0063] Frame et al. Plant J., 1994. vol. 6.

94. 948 [0064] Current Protocols in Molecular Biology Wiley and Sons, Inc. [0075]

Bibliografía distinta de patentes citada en la descripción Kishore et al. Ann. Rev. Biochem., 1988. vol. 57.

62. 663 [0003] [0003] [0004] [0004] Schulz et al. Arch Microbio/., 1984. vol. 137, 121·123 (O003J Sost et al. FEBS Lett., 1984, vol, 173.

23. 241 (0003) Kishore et al. Fed. Proc., 1986. vol. 45, 1506 [0003] Amrhein Arch Biochem. Biophys., 1990, vol. 282.

43. 436 [0003] et al. Science, 1986. vol. 233.

47. 481 (0004]